Długość telomerów w stosunku do ostrej odpowiedzi na stres u pacjentów w stanie krytycznym

Analizę długości telomerów wykonano z 2 próbek krwi, pierwszej próbki pobranej w ciągu pierwszych 72 godzin po hospitalizacji, drugiej po nie < 5 lub > 14 dniach. W przypadku pacjentów wypisanych przed 5. dniem pobrano powtórną próbkę i przeanalizowano w dniu wypisu. Obróbka próbki krwi była następująca: zebrano 5 ml krwi i krwinki czerwone (RBC) poddano lizie stosując roztwór do lizy RBC (Biological Industries, Beit Haemek, Izrael). Izolację genomowego DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu do izolacji DNA dla krwi ssaków (Roche, Mannheim, Niemcy). Pokrótce, DNA wyizolowano metodą wysalania, przemyto i wytrącono izopropanolem. DNA ponownie zawieszono w wodzie odpowiedniej do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Stężenie DNA mierzono za pomocą urządzenia NanoDrop (Thermo Fisher, USA).

Próbki DNA analizowano pod kątem długości telomerów zgodnie z metodą Cawthona (2009) [20] z niewielkimi modyfikacjami. Każdą próbkę DNA analizowano za pomocą dwóch zestawów starterów wyszczególnionych poniżej, jednego do analizy długości telomerów i jednego do analizy genów odniesienia (hemoglobina ludzka). Startery rozcieńczono do 100 µM w wodzie do PCR, a następnie do 10 µM. Próbki DNA rozcieńczono do 2,5 ng/µl w wodzie do PCR. Sekwencje starterów przedstawiono poniżej:

telc: TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA telg: ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT hbgd:_GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGGAGGAGAAGTCTGCCGTT hbgu: GGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGCTTCATCCACG TCACCTTG

Reakcje PCR przetwarzano w następujący sposób:

50°C przez 2 min, 95°C przez 5 min, pojedynczy cykl 94°C przez 15 s, 49°C przez 15 s; 40 cykli: 94°C przez 15 sek., 62°C przez 10 sek. i końcowy etap: 74°C przez 15 sek. Wszystkie reakcje przeprowadzono przy użyciu urządzenia Step One (ABI, USA).