Longitud de los telómeros en relación con la respuesta al estrés agudo en pacientes en cuidados intensivos

Los análisis de longitud de los telómeros se determinaron a partir de 2 muestras de sangre, la muestra inicial extraída en las primeras 72 horas posteriores a la hospitalización y la segunda después de no < 5 ni > 14 días. Para los pacientes dados de alta antes del día 5, se extrajo y analizó una muestra repetida el día del alta. El procesamiento de la muestra de sangre fue el siguiente: se recogieron 5 ml de sangre y los glóbulos rojos (RBC) se lisaron utilizando la solución de lisis de RBC (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). El aislamiento de ADN genómico se realizó utilizando el kit de aislamiento de ADN para sangre de mamíferos (Roche, Mannheim, Alemania). Brevemente, el ADN se aisló mediante el procedimiento de salinización, se lavó y se precipitó con isopropanol. El ADN se resuspendió en agua de calidad para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La concentración de ADN se midió utilizando el dispositivo NanoDrop (Thermo Fisher, EE. UU.).

Las muestras de ADN se analizaron para determinar la longitud de los telómeros según el método de Cawthon (2009) [20] con ligeras modificaciones. Cada muestra de ADN se analizó con dos conjuntos de cebadores que se detallan a continuación, uno para el análisis de la longitud de los telómeros y otro para el análisis del gen de referencia (hemoglobina humana). Los cebadores se diluyeron a 100 µM en agua de grado PCR y luego a 10 µM. Las muestras de ADN se diluyeron a 2,5 ng/µl en agua de grado PCR. Las secuencias de los cebadores se muestran a continuación:

telc: TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA telg: ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT hbgd:_GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGGAGGAGAAGTCTGCCGTT hbgu: GGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGCTTCATCCACGTTCACCTTG

Las reacciones PCR se procesaron de la siguiente manera:

50°C por 2 min, 95°C por 5 min, un solo ciclo de 94°C por 15 seg, 49°C por 15 seg; 40 ciclos de: 94°C por 15 seg, 62°C por 10 seg y una etapa final de: 74°C por 15 seg. Todas las reacciones se realizaron utilizando el dispositivo Step One (ABI, EE. UU.).