Telomeerlengte in relatie tot acute stressrespons bij patiënten in kritieke zorg

Telomerenlengte-analyse werd bepaald uit 2 bloedmonsters, het eerste monster werd genomen in de eerste 72 uur na ziekenhuisopname en het tweede na niet < 5 of > 14 dagen. Voor patiënten die vóór dag 5 werden ontslagen, werd een herhalingsmonster genomen en geanalyseerd op de ontslagdag. De verwerking van het bloedmonster was als volgt: 5 ml bloed werd verzameld en de rode bloedcellen (RBC) werden gelyseerd met behulp van de RBC-lysisoplossing (Biological Industries, Beit Haemek, Israël). Isolatie van genomisch DNA werd uitgevoerd met behulp van de DNA-isolatiekit voor zoogdierbloed (Roche, Mannheim, Duitsland). In het kort, DNA werd geïsoleerd door de uitzoutprocedure, gewassen en geprecipiteerd met isopropanol. Het DNA werd opnieuw gesuspendeerd in water van polymerasekettingreactie (PCR) kwaliteit. De DNA-concentratie werd gemeten met behulp van het NanoDrop-apparaat (Thermo Fisher, VS).

DNA-monsters werden geanalyseerd op telomeerlengte volgens de methode van Cawthon (2009) [20] met kleine aanpassingen. Elk DNA-monster werd geanalyseerd door twee reeksen primers die hieronder worden beschreven, één voor telomeerlengte-analyse en één voor een referentiegenanalyse (humaan hemoglobine). De primers werden verdund tot 100 µM in water van PCR-kwaliteit en daarna tot 10 µM. DNA-monsters werden verdund tot 2,5 ng/µl in water van PCR-kwaliteit. De primersequenties worden hieronder weergegeven:

telc: TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA telg: ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT hbgd:_GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGGAGGAGAAGTCTGCCGTT hbgu: GGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGCTTCATCCACGTTCACCTTG

Reactie-PCR werd als volgt verwerkt:

50°C gedurende 2 min, 95°C gedurende 5 min, een enkele cyclus van 94°C gedurende 15 sec, 49°C gedurende 15 sec; 40 cycli van: 94°C gedurende 15 sec, 62°C gedurende 10 sec en een eindtrap van: 74°C gedurende 15 sec. Alle reacties werden uitgevoerd met behulp van het Step One-apparaat (ABI, VS).