Telomerlengde i forhold til akutt stressrespons hos Critical Care-pasienter

Telomerlengdeanalyse ble bestemt fra 2 blodprøver, den første prøven ble tatt i løpet av de første 72 timene etter sykehusinnleggelse og den andre etter ikke < 5 eller > 14 dager. For pasienter utskrevet før dag 5 ble det tatt en gjentatt prøve og analysert på utskrivelsesdagen. Blodprøvebehandlingen var som følger: 5 ml blod ble samlet og de røde blodcellene (RBC) ble lysert ved å bruke RBC-lyseløsningen (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). Isolering av genomisk DNA ble utført ved å bruke DNA-isoleringssettet for pattedyrblod (Roche, Mannheim, Tyskland). Kort fortalt ble DNA isolert ved utsaltingsprosedyren, vasket og utfelt med isopropanol. DNA ble resuspendert i vann av polymerasekjedereaksjon (PCR). DNA-konsentrasjonen ble målt ved å bruke NanoDrop-enheten (Thermo Fisher, USA).

DNA-prøver ble analysert for telomerlengde i henhold til metoden til Cawthon (2009) [20] med små modifikasjoner. Hver DNA-prøve ble analysert med to sett med primere beskrevet nedenfor, ett for telomerlengdeanalyse og ett for en referansegenanalyse (humant hemoglobin). Primerne ble fortynnet til 100 uM i vann av PCR-kvalitet og deretter til 10 uM. DNA-prøver ble fortynnet til 2,5 ng/µl i vann av PCR-kvalitet. Primersekvensene er vist nedenfor:

telc: TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA tel: ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT hbgd:_GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGGAGGAGAAGTCTGCCGTT hbgu: GGCGGCGGGCGGGCGCGCGCCTCTTCTGCC

Reaksjons-PCR ble behandlet som følger:

50°C i 2 minutter, 95°C i 5 minutter, en enkelt syklus på 94°C i 15 sekunder, 49°C i 15 sekunder; 40 sykluser på: 94°C i 15 sekunder, 62°C i 10 sekunder og et siste trinn på: 74°C i 15 sekunder. Alle reaksjoner ble utført ved bruk av trinn 1-enheten (ABI, USA).