Lunghezza dei telomeri in relazione alla risposta acuta allo stress nei pazienti in terapia intensiva

L'analisi della lunghezza dei telomeri è stata determinata da 2 campioni di sangue, il campione iniziale prelevato nelle prime 72 ore dopo il ricovero e il secondo dopo non < 5 o > 14 giorni. Per i pazienti dimessi prima del giorno 5, è stato prelevato un campione ripetuto e analizzato il giorno della dimissione. L'elaborazione del campione di sangue è stata la seguente: sono stati raccolti 5 ml di sangue e i globuli rossi (RBC) sono stati lisati utilizzando la soluzione di lisi RBC (Biological Industries, Beit Haemek, Israele). L'isolamento del DNA genomico è stato eseguito utilizzando il kit di isolamento del DNA per sangue di mammifero (Roche, Mannheim, Germania). In breve, il DNA è stato isolato mediante procedura di salatura, lavato e precipitato con isopropanolo. Il DNA è stato risospeso in acqua di grado reazione a catena della polimerasi (PCR). La concentrazione di DNA è stata misurata utilizzando il dispositivo NanoDrop (Thermo Fisher, USA).

I campioni di DNA sono stati analizzati per la lunghezza dei telomeri secondo il metodo di Cawthon (2009) [20] con lievi modifiche. Ogni campione di DNA è stato analizzato da due set di primer descritti di seguito, uno per l'analisi della lunghezza dei telomeri e uno per l'analisi del gene di riferimento (emoglobina umana). I primer sono stati diluiti a 100 µM in acqua di grado PCR e quindi a 10 µM. I campioni di DNA sono stati diluiti a 2,5 ng/µl in acqua di grado PCR. Le sequenze dei primer sono mostrate di seguito:

telc: TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA telg: ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT hbgd:_GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGGAGGAGAAGTCTGCCGTT hbgu: GGCGGCGGGCGGCGCGGGGCTGGGCGGCTTCATCCACGTTCACCTTG

La PCR di reazione è stata elaborata come segue:

50°C per 2 min, 95°C per 5 min, un singolo ciclo di 94°C per 15 sec, 49°C per 15 sec; 40 cicli di: 94°C per 15sec, 62°C per 10 sec e uno stadio finale di: 74°C per 15 sec. Tutte le reazioni sono state eseguite utilizzando il dispositivo Step One (ABI, USA).