Telomeerien pituus suhteessa tehohoitopotilaiden akuuttiin stressivasteeseen

Telomeerien pituusanalyysi määritettiin kahdesta verinäytteestä, joista ensimmäinen näyte otettiin ensimmäisten 72 tunnin aikana sairaalahoidon jälkeen ja toinen alle 5 tai > 14 päivän kuluttua. Ennen päivää 5 kotiutuneista potilaista otettiin uusintanäyte ja analysoitiin kotiutuspäivänä. Verinäytteen käsittely oli seuraava: 5 ml verta kerättiin ja punasolut (RBC) lyysattiin käyttämällä RBC-lyysiliuosta (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). Genomisen DNA:n eristys suoritettiin käyttämällä DNA-eristyspakkausta nisäkäsverelle (Roche, Mannheim, Saksa). Lyhyesti sanottuna DNA eristettiin suolausmenetelmällä, pestiin ja saostettiin isopropanolilla. DNA suspensoitiin uudelleen polymeraasiketjureaktio (PCR) -laatuiseen veteen. DNA-pitoisuus mitattiin NanoDrop-laitteella (Thermo Fisher, USA).

DNA-näytteistä analysoitiin telomeerien pituus Cawthonin (2009) [20] menetelmällä pienin muutoksin. Jokainen DNA-näyte analysoitiin kahdella alukesarjalla, jotka on kuvattu alla, yksi telomeeripituusanalyysiä varten ja toinen vertailugeenianalyysiä varten (ihmisen hemoglobiini). Alukkeet laimennettiin 100 uM PCR-laatuiseen veteen ja sitten 10 uM. DNA-näytteet laimennettiin pitoisuuteen 2,5 ng/ul PCR-luokan veteen. Alukkeiden sekvenssit on esitetty alla:

puhelin: TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA telg: ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT hbgd:_GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGGAGGAGAAGTCTGCCGTT hbgu: GGCGTCGGGCTGGGTCGGCT ATCCACGTTCACCTTG

Reaktio-PCR käsiteltiin seuraavasti:

50 °C 2 minuuttia, 95 °C 5 minuuttia, yksi sykli 94 °C 15 sekuntia, 49 °C 15 sekuntia; 40 sykliä: 94 °C 15 sekuntia, 62 °C 10 sekuntia ja viimeinen vaihe: 74 °C 15 sekuntia. Kaikki reaktiot suoritettiin käyttämällä Step One -laitetta (ABI, USA).