Comprimento dos telômeros em relação à resposta de estresse agudo em pacientes de terapia intensiva

A análise do comprimento dos telômeros foi determinada a partir de 2 amostras de sangue, a amostra inicial coletada nas primeiras 72 horas após a internação e a segunda após não < 5 ou > 14 dias. Para pacientes que receberam alta antes do dia 5, uma amostra repetida foi coletada e analisada no dia da alta. O processamento da amostra de sangue foi o seguinte: 5 mL de sangue foram coletados e os glóbulos vermelhos (RBC) foram lisados ​​usando a solução de lise de RBC (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). O isolamento do DNA genômico foi realizado usando o kit de isolamento de DNA para sangue de mamíferos (Roche, Mannheim, Alemanha). Resumidamente, o DNA foi isolado pelo procedimento de salting out, lavado e precipitado por isopropanol. O DNA foi ressuspenso em água de grau de reação em cadeia da polimerase (PCR). A concentração de DNA foi medida usando o dispositivo NanoDrop (Thermo Fisher, EUA).

As amostras de DNA foram analisadas quanto ao comprimento dos telômeros de acordo com o método de Cawthon (2009) [20] com pequenas modificações. Cada amostra de DNA foi analisada por dois conjuntos de iniciadores detalhados abaixo, um para análise do comprimento dos telômeros e outro para uma análise do gene de referência (hemoglobina humana). Os primers foram diluídos para 100 µM em água grau PCR e depois para 10 µM. As amostras de DNA foram diluídas para 2,5 ng/µl em água grau PCR. As sequências dos primers são mostradas abaixo:

telc: TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA telg: ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT hbgd: _GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGGAGGAGAAGTCTGCCGTT hbgu: GGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGCTTCATCCACGTTCACCTTG

A reação de PCR foi processada da seguinte forma:

50°C por 2 min, 95°C por 5 min, um único ciclo de 94°C por 15 seg, 49°C por 15 seg; 40 ciclos de: 94°C por 15 seg, 62°C por 10 seg e um estágio final de: 74°C por 15 seg. Todas as reações foram realizadas com o equipamento Step One (ABI, EUA).