Telomerlængde i forhold til akut stressrespons hos kritiske patienter

Telomerlængdeanalyse blev bestemt ud fra 2 blodprøver, den første prøve blev udtaget i de første 72 timer efter indlæggelse og den anden efter ikke < 5 eller > 14 dage. For patienter, der blev udskrevet før dag 5, blev en gentagen prøve udtaget og analyseret på udskrivelsesdagen. Blodprøvebehandlingen var som følger: 5 ml blod blev opsamlet, og de røde blodlegemer (RBC) blev lyseret under anvendelse af RBC-lyseopløsningen (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). Isolering af genomisk DNA blev udført ved at anvende DNA-isoleringssættet til pattedyrsblod (Roche, Mannheim, Tyskland). Kort fortalt blev DNA isoleret ved udsaltning, vasket og præcipiteret med isopropanol. DNA'et blev resuspenderet i vand af polymerasekædereaktion (PCR). DNA-koncentrationen blev målt ved hjælp af NanoDrop-enheden (Thermo Fisher, USA).

DNA-prøver blev analyseret for telomerlængde i henhold til metoden ifølge Cawthon (2009) [20] med små modifikationer. Hver DNA-prøve blev analyseret med to sæt primere beskrevet nedenfor, et til telomerlængdeanalyse og et til en referencegenanalyse (humant hæmoglobin). Primerne blev fortyndet til 100 µM i vand af PCR-kvalitet og derefter til 10 µM. DNA-prøver blev fortyndet til 2,5 ng/µl i vand af PCR-kvalitet. Primersekvenserne er vist nedenfor:

telc: TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA telg: ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT hbgd:_GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGGAGGAGAAGTCTGCCGTT hbgu: GGCGGCGGGCGGGCGCGTCCCTCTTCTGCC

Reaktions-PCR blev behandlet som følger:

50°C i 2 minutter, 95°C i 5 minutter, en enkelt cyklus på 94°C i 15 sekunder, 49°C i 15 sekunder; 40 cyklusser af: 94°C i 15 sekunder, 62°C i 10 sekunder og et sidste trin på: 74°C i 15 sekunder. Alle reaktioner blev udført under anvendelse af trin 1-anordningen (ABI, USA).