Длина теломер в связи с острой реакцией на стресс у пациентов в критическом состоянии

Анализ длины теломер определяли из 2 образцов крови, первоначальный образец был взят в первые 72 часа после госпитализации, а второй – не позднее, чем через 5 или > 14 дней. Для пациентов, выписанных до 5-го дня, был взят повторный образец и проанализирован в день выписки. Обработка образца крови была следующей: отбирали 5 мл крови и лизировали эритроциты (эритроциты) с использованием раствора для лизиса эритроцитов (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). Выделение геномной ДНК проводили с использованием набора для выделения ДНК из крови млекопитающих (Roche, Мангейм, Германия). Вкратце, ДНК выделяли методом высаливания, промывали и осаждали изопропанолом. ДНК ресуспендировали в воде для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Концентрацию ДНК измеряли с помощью прибора NanoDrop (Thermo Fisher, США).

Образцы ДНК анализировали на длину теломер по методу Cawthon (2009) [20] с небольшими модификациями. Каждый образец ДНК анализировали с помощью двух наборов праймеров, описанных ниже, один для анализа длины теломер и один для анализа эталонного гена (гемоглобин человека). Праймеры разбавляли до 100 мкМ в воде для ПЦР, а затем до 10 мкМ. Образцы ДНК разбавляли до 2,5 нг/мкл водой для ПЦР. Последовательности праймеров показаны ниже:

telc: TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA telg: ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT hbgd:_GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGGAGGAAGTCTGCCGTT hbgu: GGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGCTTCATCCACGTTCACCTTG

Реакцию ПЦР обрабатывали следующим образом:

50°С 2 мин, 95°С 5 мин, одиночный цикл 94°С 15 сек, 49°С 15 сек; 40 циклов: 94°C в течение 15 секунд, 62°C в течение 10 секунд и заключительный этап: 74°C в течение 15 секунд. Все реакции проводили на приборе Step One (ABI, США).