Mechanismus opožděné apoptózy neutrofilů u akutního poškození plic

1. Literární podklady syndrom roztomilé respirační tísně (ARDS) je klinický syndrom charakterizovaný respirační tísní a progresivní hypoxémií, který je způsoben difuzním alveolárním a plicním intersticiálním edémem způsobeným různými plicními a extrapulmonálními faktory jinými než kardiogenní faktory. Incidence ARDS je až 75/10 000 za rok a nejčastější příčinou jsou sepse a plicní infekce. V minulosti se obecně věřilo, že nadměrná imunitní aktivace je jádrem patofyziologie ARDS a neutrofily jsou uznávány jako hlavní hnací síla zánětlivé hyperaktivity a poškození plic u ARDS. Ačkoli byl v posledních 50 letech učiněn určitý pokrok v epidemiologii, patogenezi a patofyziologii ARDS a klinické výsledky některých pacientů s ARDS byly zlepšeny optimalizací způsobu mechanické ventilace a léčby tekutinami, stejně jako pronační ventilace a užívání svalových relaxancií je ARDS stále jednou z nejčastějších příčin úmrtí a invalidity na jednotkách intenzivní péče. Úmrtnost na toto onemocnění je v současnosti až 30-40 %. V klinické praxi stále chybí účinná léčiva pro léčbu ARDS a ani glukokortikoidy aplikované k nadměrné aktivaci imunity nedosahují dobrých výsledků. Souvisí to s nejasnou patogenezí ARDS. Proto je stále horkým a obtížným bodem dále zkoumat patogenezi a progresi ARDS a nalézt nové terapeutické cíle.

V minulosti byl zralý PMN v periferní krvi obecně považován za funkční buňku v konečném stádiu, ale je široce zapojen do různých vrozených imunitních odpovědí (včetně zánětu, infekce, nádoru, autoimunity atd.) a může přijmout velmi odlišný efektor mechanismy. Proto s prohlubujícím se výzkumem byly v posledních letech identifikovány podtypy neutrofilů s různými funkcemi (jako je imunitní regulace a oprava): cd16dimcd62lbrightpmn a cd16brightcd62ldimmpmn. V ustáleném stavu zdravých lidí tvoří klasické zralé neutrofily (cd16brightcd62lbright) v periferní krvi více než 98 % celkového PMN a podíl těchto dvou subtypů neutrofilů je relativně nízký. Při zánětlivém stavu se významně zvýšil podíl neutrofilů cd16dimcd62lbright a cd16brightcd62ldim. Proteomická analýza ukázala, že mezi těmito dvěma podtypy neutrofilů byly významné rozdíly. Jádro podskupiny cd16dimcd62lbright neutrofilů je pruhované, které se uvolňuje z kostní dřeně po stimulaci lipopolysacharidem (LPS). Tvoří 20 % - 25 % PMN v plné krvi v modelu infekce LPS. Rychlost apoptózy je významně snížena a bakteriostatické účinky, jako je oxidační vzplanutí a fagocytóza, jsou významně zesíleny; Naopak podskupina neutrofilů cd16brightcd62ldim má sníženou antibakteriální schopnost a vykazuje imunosupresivní fenotyp. Jde o nově objevený subtyp neutrofilů s imunosupresivní funkcí v posledních letech, který může inhibovat proliferaci T buněk, což souvisí s imunosupresí na experimentálním modelu lidské endotoxémie.

V našich předchozích studiích jsme úspěšně získali nový aminokyselinový derivát ocotillol ginsenosidu, který může mít farmakologické aktivity ocotillol ginsenosidu a glycinu a má potenciální roli ve zlepšení zpoždění apoptózy a imunosuprese subtypů neutrofilů ARDS. potenciál vývoje nových léků pro léčbu ARDS.

2. Experimentální kroky jsou následující:

1. Vzorky periferní krve od pacientů s ARDS byly odebrány k detekci zánětlivých markerů;
2. Neutrofily byly izolovány z periferní krve pacientů s ARDS;
3. Podíl subtypů neutrofilů byl detekován průtokovou cytometrií a subtypy neutrofilů byly izolovány;
4. Subtypy neutrofilů byly kultivovány společně s T lymfocyty periferní krve pro detekci jejich schopnosti inhibovat proliferaci T buněk a apoptózu subtypů neutrofilů;
5. Neutrofily v periferní krvi a různé dávky derivátů ginsenosidu glycinu u pacientů s ARDS (2050100 μm) Po inkubaci po dobu 20 hodin byla rychlost apoptózy 28 hodin.
6. Bax, Mcl-1 a ​​štěpená kaspáza-3 byly detekovány Western blotem.
7. Vysokovýkonná PCR a mapp-4 byly použity k detekci exprese genů souvisejících s apoptózou v dráze akg38k.
8. Metabolomická analýza: odeberte periferní krev pacientů s ARDS pro metabolomickou analýzu.

3. Metody výzkumu

1. Diagnostická kritéria: diagnostická kritéria ARDS viz Berlínský standard z roku 2012.
2. Kritéria pro zařazení: (1) věk ≥ 18 let; (2) Diagnóza akutního poškození plic do 24 hodin (berlínská diagnostická kritéria pro akutní poškození plic)
3. Kritéria vyloučení: (1) věk < 18 let; (2) propuštění nebo smrt do 48 hodin po přijetí; (3) Těhotenství nebo šestinedělí; (4) Pacienti s imunosupresí.

4. Zkušební postup

1. Metody: Byli vybráni pacienti na JIP, kteří splnili kritéria pro zařazení
2. Proces informovaného souhlasu: po komunikaci s pacientem nebo zákonným zástupcem podepište formulář informovaného souhlasu

5. Zahájení a ukončení experimentu Informovaný souhlas byl podepsán v lednu 2020

6. Zabezpečení dat a plán monitorování Zdravotní dokumentace pacienta (studijní zdravotní záznamy / CRF, testovací formuláře atd.) bude kompletně vedena v nemocnici. Výsledky laboratorních testů a dalších vyšetření lékař zaznamená do své chorobopisu. Výzkumníci, etická komise a administrativa léků budou mít přístup k jeho zdravotní dokumentaci. Žádná veřejná zpráva o výsledcích studie neodhalí individuální identitu pacienta. Vynaložíme veškeré úsilí na ochranu informací o pacientech v rozsahu povoleném zákonem. Podle etiky lékařského výzkumu budou experimentální data s výjimkou informací o ochraně osobních údajů k dispozici pro veřejný dotaz a sdílení a dotazování a sdílení bude omezeno na elektronickou databázi založenou na síti, aby bylo zajištěno, že nebudou zveřejněny žádné informace o soukromí.

7. Dodržujte etické zásady a příslušné zákony a předpisy Zda se studie zúčastníte či nikoli, závisí zcela na přání pacientů a jejich zákonných zástupců. Pacienti a jejich rodiny mohou odmítnout účast ve studii nebo odstoupit ze studie kdykoli v průběhu studie. Neovlivní to vztah mezi pacientem a jeho lékařem a neovlivní to ani ztrátu léčebných či jiných výhod pro pacienta.

8. Plán statistické analýzy Pro statistickou analýzu byl použit software SPSS15.0. Naměřená data byla vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka, pro srovnání mezi skupinami byl použit t test nebo neparametrický test, pro počítání dat byl použit chí kvadrát test a pro vztah mezi proměnnými byla použita lineární korelační analýza, P < 0,05 bylo považováno za statisticky významný.