Механизм замедленного апоптоза нейтрофилов при остром повреждении легких

1. Литературная основа. Милый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) — клинический синдром, характеризующийся респираторным дистресс-синдромом и прогрессирующей гипоксемией, который обусловлен диффузным альвеолярным и интерстициальным отеком легких, вызванным различными легочными и внелегочными факторами, отличными от кардиогенных. Заболеваемость ОРДС достигает 75/10 000 в год, а наиболее частыми причинами являются сепсис и легочная инфекция. В прошлом считалось, что чрезмерная иммунная активация является основой патофизиологии ОРДС, а нейтрофилы признаны основным фактором воспалительной гиперактивности и повреждения легких при ОРДС. Хотя за последние 50 лет в эпидемиологии, патогенезе и патофизиологии ОРДС достигнут некоторый прогресс, а клинические исходы у некоторых пациентов с ОРДС улучшились за счет оптимизации режима ИВЛ и инфузионной терапии, а также вентиляции в положении лежа и применения миорелаксантов, ОРДС до сих пор остается одной из наиболее частых причин смерти и инвалидности в отделениях интенсивной терапии. Смертность от заболевания в настоящее время достигает 30-40%. Эффективных препаратов для лечения ОРДС в клинике по-прежнему не хватает, и даже глюкокортикоиды, применяемые для гиперактивации иммунитета, не дали хороших результатов. Это связано с неясным патогенезом ОРДС. Таким образом, дальнейшее изучение патогенеза и прогрессирования ОРДС и поиск новых терапевтических мишеней по-прежнему является горячей и сложной задачей.

В прошлом зрелые ПЯЛ в периферической крови обычно считались функциональной клеткой на терминальной стадии, но они широко вовлечены в различные врожденные иммунные реакции (включая воспаление, инфекцию, опухоль, аутоиммунитет и т. д.) и могут принимать очень разные эффекторные реакции. механизмы. Поэтому с углублением исследований в последние годы были идентифицированы подтипы нейтрофилов с различными функциями (такими как иммунная регуляция и репарация): cd16dimcd62lbrightpmn и cd16brightcd62ldimmpmn. В стабильном состоянии здоровых людей классические зрелые нейтрофилы (cd16brightcd62lbright) в периферической крови составляют более 98% от общего количества ПЯЛ, а доля двух подтипов нейтрофилов относительно невелика. При воспалительном состоянии доля cd16dimcd62lbright и cd16brightcd62ldim нейтрофилов значительно увеличивалась. Протеомный анализ показал, что существуют значительные различия между двумя подтипами нейтрофилов. Ядро подгруппы нейтрофилов cd16dimcd62lbright полосатое, которое высвобождается из костного мозга после стимуляции липополисахаридом (ЛПС). На его долю приходится 20-25% ПЯЛ в цельной крови в модели инфекции ЛПС. Скорость апоптоза значительно снижается, а бактериостатические эффекты, такие как окислительный взрыв и фагоцитоз, значительно усиливаются; Напротив, подгруппа нейтрофилов cd16brightcd62ldim обладает сниженной антибактериальной способностью и демонстрирует иммуносупрессивный фенотип. Это недавно обнаруженный в последние годы подтип нейтрофилов с иммуносупрессивной функцией, который может ингибировать пролиферацию Т-клеток, что связано с иммуносупрессией в экспериментальной модели эндотоксемии человека.

В наших предыдущих исследованиях мы успешно получили новое аминокислотное производное окотиллола гинзенозида, которое может обладать фармакологической активностью окотиллола гинзенозида и глицина и играть потенциальную роль в улучшении задержки апоптоза и иммуносупрессии подтипов нейтрофилов ОРДС, а также возможности разработки новых препаратов для лечения ОРДС.

2. Экспериментальные этапы следующие:

1. Образцы периферической крови пациентов с ОРДС были собраны для выявления маркеров воспаления;
2. Нейтрофилы выделяли из периферической крови больных ОРДС;
3. Долю подтипов нейтрофилов определяли с помощью проточной цитометрии, и подтипы нейтрофилов выделяли;
4. Подтипы нейтрофилов культивировали совместно с Т-лимфоцитами периферической крови для определения их способности ингибировать пролиферацию Т-клеток и апоптоз подтипов нейтрофилов;
5. Нейтрофилы периферической крови и различные дозы производных гинзенозида глицина у больных ОРДС (2050100 мкМ) После инкубации в течение 20 часов скорость апоптоза составила 28 часов.
6. Bax, Mcl-1 и расщепленную каспазу-3 определяли вестерн-блоттингом.
7. Высокопроизводительная ПЦР и mapp-4 использовались для обнаружения экспрессии генов, связанных с апоптозом, в пути akg38k.
8. Метаболомный анализ: собрать периферическую кровь пациентов с ОРДС для метаболомного анализа.

3. Методы исследования

1. Диагностические критерии: см. Берлинский стандарт 2012 г. по диагностическим критериям ОРДС.
2. Критерии включения: (1) возраст ≥ 18 лет; (2) Диагностика острого повреждения легких в течение 24 часов (Берлинские диагностические критерии острого повреждения легких)
3. Критерии исключения: (1) возраст < 18 лет; (2) Выписка или смерть в течение 48 часов после госпитализации; (3) Беременность или послеродовой период; (4) Пациенты с иммуносупрессией.

4. Процедура испытаний

1. Методы: были отобраны пациенты отделения интенсивной терапии, которые соответствовали критериям включения.
2. Процесс информированного согласия: подпишите форму информированного согласия после общения с пациентом или его законным представителем.

5. Начало и окончание эксперимента Информированное согласие подписано в январе 2020 г.

6. Безопасность данных и план мониторинга. Медицинские карты пациента (исследуемые медицинские карты / CRF, формы анализов и т. д.) будут полностью храниться в больнице. Результаты лабораторных анализов и других обследований врач фиксирует в своей медицинской карте. Исследователям, комитету по этике и администрации лекарств будет разрешен доступ к его медицинским записям. Никакой публичный отчет о результатах исследования не раскроет личность пациента. Мы приложим все усилия для защиты информации о пациентах в той мере, в какой это разрешено законом. В соответствии с этикой медицинских исследований, за исключением информации о конфиденциальности, экспериментальные данные будут доступны для публичного запроса и обмена, а запрос и обмен будут ограничены электронной базой данных на основе сети, чтобы гарантировать, что никакая информация о конфиденциальности не будет раскрыта.

7. Соблюдать этические принципы и соответствующие законы и правила. Участие или отказ от участия в исследовании полностью зависит от желания пациентов и их законных представителей. Пациенты и их семьи могут отказаться от участия в исследовании или выйти из исследования в любое время в ходе исследования. Это не повлияет на отношения между пациентом и его врачом, а также не повлияет на потерю медицинских или других льгот для пациента.

8. План статистического анализа Для статистического анализа использовалось программное обеспечение SPSS15.0. Данные измерений выражали как среднее значение ± стандартное отклонение, для сравнения между группами использовали t-критерий или непараметрический критерий, для подсчета данных использовали критерий хи-квадрат, а для взаимосвязи между переменными использовали линейный корреляционный анализ, P < 0,05 рассматривали как статистически значимый.