Mechanizm opóźnionej apoptozy neutrofili w ostrym uszkodzeniu płuc

1. Podstawa literaturowa Zespół słodkiej niewydolności oddechowej (ARDS) jest zespołem klinicznym charakteryzującym się niewydolnością oddechową i postępującą hipoksemią, która jest spowodowana rozlanym obrzękiem pęcherzyków płucnych i śródmiąższowego płuc wywołanym przez różne czynniki płucne i pozapłucne inne niż czynniki kardiogenne. Częstość występowania ARDS sięga 75/10 000 rocznie, a najczęstszą przyczyną jest posocznica i infekcja płuc. W przeszłości powszechnie uważano, że nadmierna aktywacja immunologiczna jest podstawą patofizjologii ARDS, a neutrofile są uznawane za główną przyczynę nadaktywności zapalnej i uszkodzenia płuc w ARDS. Chociaż w ciągu ostatnich 50 lat poczyniono pewne postępy w epidemiologii, patogenezie i patofizjologii ARDS, a wyniki kliniczne niektórych pacjentów z ARDS uległy poprawie dzięki optymalizacji trybu wentylacji mechanicznej i płynoterapii, a także wentylacji na brzuchu i stosowania środków zwiotczających mięśnie, ARDS jest nadal jedną z najczęstszych przyczyn zgonów i inwalidztwa na oddziałach intensywnej terapii. Śmiertelność z powodu tej choroby wynosi obecnie nawet 30-40%. Wciąż brakuje skutecznych leków do leczenia ARDS w praktyce klinicznej, a nawet glikokortykosteroidy stosowane w celu nadaktywacji immunologicznej nie przynoszą dobrych rezultatów. Ma to związek z niejasną patogenezą ARDS. Dlatego nadal jest to gorący i trudny punkt do dalszego badania patogenezy i progresji ARDS oraz znalezienia nowych celów terapeutycznych.

W przeszłości dojrzała PMN we krwi obwodowej była ogólnie uważana za funkcjonalną komórkę w końcowym stadium, ale jest szeroko zaangażowana w różne wrodzone odpowiedzi immunologiczne (w tym zapalenie, infekcję, nowotwór, autoimmunizację itp.) i może przyjmować bardzo różne efektory mechanizmy. Dlatego wraz z pogłębieniem badań w ostatnich latach zidentyfikowano podtypy neutrofili o różnych funkcjach (takich jak regulacja immunologiczna i naprawa): cd16dimcd62lbrightpmn i cd16brightcd62ldimpmn. W stanie stacjonarnym zdrowych ludzi, klasyczne dojrzałe neutrofile (cd16brightcd62lbright) we krwi obwodowej stanowią ponad 98% całkowitego PMN, a odsetek tych dwóch podtypów neutrofili jest stosunkowo niski. W stanie zapalnym znacząco wzrósł odsetek neutrofili cd16dimcd62lbright i cd16brightcd62ldim. Analiza proteomiczna wykazała znaczące różnice między dwoma podtypami neutrofili. Jądro podgrupy neutrofili cd16dimcd62lbright jest prążkowane, które jest uwalniane ze szpiku kostnego po stymulacji lipopolisacharydem (LPS). Stanowi 20% - 25% PMN we krwi pełnej w modelu zakażenia LPS. Szybkość apoptozy jest znacznie zmniejszona, a efekty bakteriostatyczne, takie jak wybuch oksydacyjny i fagocytoza, są znacznie zwiększone; Wręcz przeciwnie, podgrupa neutrofilów cd16brightcd62ldim ma zmniejszoną zdolność przeciwbakteryjną i wykazuje fenotyp immunosupresyjny. Jest to nowo odkryty podtyp neutrofili o funkcji immunosupresyjnej w ostatnich latach, który może hamować proliferację limfocytów T, co jest związane z immunosupresją w eksperymentalnym modelu ludzkiej endotoksemii.

W naszych poprzednich badaniach z powodzeniem uzyskaliśmy nową pochodną aminokwasową ginsenozydu ocotillolu, która może mieć działanie farmakologiczne ginsenozydu ocotillolu i glicyny i ma potencjalną rolę w poprawie opóźnienia apoptozy i immunosupresji podtypów neutrofili ARDS i ma potencjał rozwoju nowych leków do leczenia ARDS.

2. Etapy eksperymentalne są następujące:

1. Próbki krwi obwodowej od pacjentów z ARDS pobrano w celu wykrycia markerów stanu zapalnego;
2. Neutrofile wyizolowano z krwi obwodowej pacjentów z ARDS;
3. Proporcję podtypów neutrofilów wykrywano za pomocą cytometrii przepływowej i izolowano podtypy neutrofili;
4. Podtypy neutrofili hodowano wspólnie z limfocytami T krwi obwodowej w celu wykrycia ich zdolności do hamowania proliferacji limfocytów T i apoptozy podtypów neutrofili;
5. Neutrofile krwi obwodowej i różne dawki pochodnych glicyny ginsenozydu u pacjentów z ARDS (2050100 µm) Po 20h inkubacji tempo apoptozy wyniosło 28h.
6. Bax, Mcl-1 i rozszczepioną kaspazę-3 wykryto metodą Western blot.
7. Do wykrywania ekspresji genów związanych z apoptozą w szlaku akg38k zastosowano wysokowydajny PCR i mapp-4.
8. Analiza metabolomiczna: pobierz krew obwodową pacjentów z ARDS do analizy metabolomicznej.

3. Metody badawcze

1. Kryteria diagnostyczne: patrz standard berliński z 2012 r. dotyczący kryteriów diagnostycznych ARDS.
2. Kryteria włączenia: (1) wiek ≥ 18 lat; (2) Rozpoznanie ostrego uszkodzenia płuc w ciągu 24 godzin (berlińskie kryteria diagnostyczne ostrego uszkodzenia płuc)
3. Kryteria wykluczenia: (1) wiek < 18 lat; (2) Wypisanie lub śmierć w ciągu 48 godzin po przyjęciu; (3) Ciąża lub połóg; (4) Pacjenci z immunosupresją.

4. Procedura testowa

1. Metody: Wybrano pacjentów OIT spełniających kryteria włączenia
2. Proces świadomej zgody: podpisz formularz świadomej zgody po komunikowaniu się z pacjentem lub przedstawicielem prawnym

5. Rozpoczęcie i zakończenie eksperymentu Świadoma zgoda została podpisana w styczniu 2020 r

6. Bezpieczeństwo danych i plan monitorowania Dokumentacja medyczna pacjenta (dokumentacja badawcza / CRF, formularze badań itp.) będzie w całości przechowywana w szpitalu. Lekarz odnotuje wyniki badań laboratoryjnych i innych badań w swojej dokumentacji medycznej. Naukowcy, komisja etyczna i administracja lekami uzyskają dostęp do jego dokumentacji medycznej. Żaden publiczny raport o wynikach badania nie ujawni indywidualnej tożsamości pacjenta. Dołożymy wszelkich starań, aby chronić dane pacjentów w zakresie dozwolonym przez prawo. Zgodnie z etyką badań medycznych, z wyjątkiem informacji o prywatności danych osobowych, dane eksperymentalne będą dostępne do publicznego zapytania i udostępniania, a zapytanie i udostępnianie będą ograniczone do elektronicznej bazy danych opartej na sieci, aby zapewnić, że żadne informacje dotyczące prywatności nie zostaną ujawnione.

7. Przestrzegaj zasad etycznych oraz odpowiednich praw i przepisów To, czy wziąć udział w badaniu, czy też nie, zależy wyłącznie od życzeń pacjentów i ich przedstawicieli prawnych. Pacjenci i ich rodziny mogą odmówić udziału w badaniu lub wycofać się z badania w dowolnym momencie w trakcie trwania badania. Nie wpłynie to na relacje między pacjentem a jego lekarzem ani na utratę przez pacjenta korzyści medycznych lub innych.

8. Plan analizy statystycznej Do analizy statystycznej wykorzystano oprogramowanie SPSS15.0. Dane pomiarowe wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe, do porównań między grupami zastosowano test t lub test nieparametryczny, do zliczenia danych zastosowano test chi-kwadrat, a do związku między zmiennymi zastosowano analizę korelacji liniowej, przy czym P < 0,05 uznano za istotne statystycznie.