急性肺损伤延迟性中性粒细胞凋亡机制

1.文献基础 急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种以呼吸窘迫和进行性低氧血症为特征的临床综合征，由除心源性因素外的各种肺及肺外因素引起弥漫性肺泡和肺间质水肿所致。 ARDS发病率高达每年75/10 000，其中败血症和肺部感染是最常见的病因。 以往普遍认为免疫过度激活是ARDS病理生理的核心，中性粒细胞被认为是ARDS炎症亢进和肺损伤的核心驱动因素。 尽管近 50 年来在 ARDS 的流行病学、发病机制和病理生理学方面取得了一些进展，通过优化机械通气和液体治疗模式以及俯卧位通气和使用肌肉松弛剂后，ARDS仍然是重症监护病房中最常见的死亡和残疾原因之一，该病的死亡率目前高达30-40%。 临床上尚缺乏治疗ARDS的有效药物，甚至应用糖皮质激素治疗免疫过度激活也未取得良好效果。 这与ARDS发病机制不明有关。 因此，进一步探讨ARDS的发病机制和进展，寻找新的治疗靶点，仍是研究的热点和难点。

过去，外周血中成熟的PMN一般被认为是终末期的功能细胞，但它广泛参与不同的先天免疫反应（包括炎症、感染、肿瘤、自身免疫等），并能采用截然不同的效应器机制。 因此，随着研究的深入，近年来发现了具有不同功能（如免疫调节和修复）的中性粒细胞亚型：cd16dimcd62lbrightpmn和cd16brightcd62ldimmpmn。 在健康人的稳定状态下，外周血中经典的成熟中性粒细胞（cd16brightcd62lbright）占PMN总数的98%以上，两种中性粒细胞亚型的比例相对较低。 在炎症状态下，cd16dimcd62lbright和cd16brightcd62ldim中性粒细胞的比例明显增加。 蛋白质组学分析表明，两种亚型的中性粒细胞存在显着差异。 cd16dimcd62lbright中性粒细胞亚群的细胞核呈带状，经脂多糖（LPS）刺激后从骨髓中释放出来。 在LPS感染模型中占全血PMN的20%～25%。 细胞凋亡率明显降低，氧化爆发、吞噬等抑菌作用明显增强；相反，cd16brightcd62ldim中性粒细胞亚群抗菌能力降低，表现出免疫抑制表型。 是近年来新发现的具有免疫抑制功能的中性粒细胞亚型，能抑制T细胞增殖，与实验性人内毒素血症模型中的免疫抑制有关。

我们在前期研究中成功获得了一种新的氨基酸衍生物奥可替醇人参皂苷，它可能具有奥可替醇人参皂苷和甘氨酸的药理活性，具有潜在的改善ARDS中性粒细胞亚型细胞凋亡延迟和免疫抑制的作用，具有治疗 ARDS 的新药开发潜力。

2、实验步骤如下：

1. 收集 ARDS 患者的外周血样本以检测炎症标志物；
2. 从ARDS患者的外周血中分离出中性粒细胞；
3. 流式细胞术检测中性粒细胞亚型比例，分离中性粒细胞亚型；
4. 中性粒细胞亚型与外周血T淋巴细胞共培养，检测其抑制T细胞增殖和中性粒细胞亚型凋亡的能力；
5. ARDS患者外周血中性粒细胞与不同剂量人参皂苷甘氨酸衍生物(2050100 μm)孵育20h后，细胞凋亡率为28h。
6. 通过蛋白质印迹检测 Bax、Mcl-1 和裂解的 caspase-3。
7. 采用高通量PCR和mapp-4检测akg38k通路中凋亡相关基因的表达。
8. 代谢组学分析：采集ARDS患者外周血进行代谢组学分析。

三、研究方法

1. 诊断标准：ARDS诊断标准参照2012年柏林标准。
2. 纳入标准：（1）年龄≥18岁； （2）24小时内诊断为急性肺损伤（急性肺损伤柏林诊断标准）
3. 排除标准：（1）年龄<18岁； (2)入院后48小时内出院或死亡； (3) 妊娠期或产褥期； (4)免疫抑制患者。

4. 测试程序

1. 方法：选择符合纳入标准的ICU患者
2. 知情同意流程：与患者或法定代表人沟通后签署知情同意书

五、实验起止时间 2020年1月签署知情同意书

6. 数据安全和监测计划 患者的病历（研究病历/CRF、化验单等）将完整保存在医院。 医生会将化验和其他检查的结果记录在他的病历中。 研究人员、伦理委员会和药物管理局将被允许访问他的病历。 任何关于研究结果的公开报告都不会透露患者的个人身份。 我们将尽一切努力在法律允许的范围内保护患者信息。 根据医学研究伦理，除个人隐私信息外，实验数据将开放供公众查询和共享，查询和共享仅限于基于网络的电子数据库，确保不泄露个人隐私信息。

七、遵守伦理原则和相关法律法规 是否参加研究完全取决于患者及其法定代表人的意愿。 在研究过程中，患者及其家属可以随时拒绝参加研究或退出研究。 这不会影响患者与医生之间的关系，也不会影响患者失去医疗或其他利益。

八、统计分析方案 采用SPSS15.0软件进行统计分析。 计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验或非参数检验，计数资料采用卡方检验，变量间关系采用线性相关分析，P<0.05为具有统计学意义。