Mecanismo de apoptose tardia de neutrófilos na lesão pulmonar aguda

1. Baseada na literatura, a síndrome do desconforto respiratório bonito (SDRA) é uma síndrome clínica caracterizada por desconforto respiratório e hipoxemia progressiva, causada por edema difuso alveolar e intersticial pulmonar causado por vários fatores pulmonares e extrapulmonares além dos fatores cardiogênicos. A taxa de incidência de SDRA chega a 75/10.000 por ano, e a sepse e a infecção pulmonar são as causas mais comuns. No passado, acreditava-se que a ativação imune excessiva é o núcleo da fisiopatologia da SDRA, e os neutrófilos são reconhecidos como o principal fator de hiperatividade inflamatória e lesão pulmonar na SDRA. Embora algum progresso tenha sido feito na epidemiologia, patogênese e fisiopatologia da SDRA nos últimos 50 anos, e os resultados clínicos de alguns pacientes com SDRA tenham melhorado pela otimização do modo de ventilação mecânica e tratamento com fluidos, bem como ventilação prona e o uso de relaxantes musculares, SDRA ainda é uma das causas mais comuns de morte e incapacidade em unidades de terapia intensiva. A taxa de mortalidade da doença é atualmente tão alta quanto 30-40%. Ainda há carência de drogas efetivas para o tratamento da SDRA na clínica, e mesmo os glicocorticoides aplicados para superativação imune não têm obtido bons resultados. Isso está relacionado à patogênese pouco clara da SDRA. Portanto, ainda é um ponto quente e difícil explorar mais a patogênese e progressão da SDRA e encontrar novos alvos terapêuticos.

No passado, PMN maduro no sangue periférico era geralmente considerado como uma célula funcional no estágio final, mas está amplamente envolvido em diferentes respostas imunes inatas (incluindo inflamação, infecção, tumor, autoimunidade, etc.) mecanismos. Portanto, com o aprofundamento das pesquisas, foram identificados nos últimos anos subtipos de neutrófilos com diferentes funções (como regulação e reparo imunológico): cd16dimcd62lbrightpmn e cd16brightcd62ldimmpmn. No estado estacionário de pessoas saudáveis, os neutrófilos maduros clássicos (cd16brightcd62lbright) no sangue periférico representam mais de 98% do total de PMN, e a proporção dos dois subtipos de neutrófilos é relativamente baixa. No estado inflamatório, a proporção de neutrófilos cd16dimcd62lbright e cd16brightcd62ldim aumentou significativamente. A análise proteômica mostrou que houve diferenças significativas entre os dois subtipos de neutrófilos. O núcleo do subgrupo de neutrófilos cd16dimcd62lbright é bandado, que é liberado da medula óssea após ser estimulado por lipopolissacarídeo (LPS). É responsável por 20% - 25% de PMN no sangue total no modelo de infecção por LPS. A taxa de apoptose é significativamente reduzida e os efeitos bacteriostáticos, como explosão oxidativa e fagocitose, são significativamente aumentados; Pelo contrário, o subgrupo de neutrófilos cd16brightcd62ldim tem capacidade antibacteriana reduzida e apresenta fenótipo imunossupressor. É um subtipo de neutrófilos recentemente descoberto com função imunossupressora nos últimos anos, que pode inibir a proliferação de células T, que está relacionada à imunossupressão no modelo experimental de endotoxemia humana.

Em nossos estudos anteriores, obtivemos com sucesso um novo derivado de aminoácido do ocotilol ginsenosídeo, que pode ter as atividades farmacológicas do ocotilol ginsenosídeo e da glicina, e tem um papel potencial em melhorar o retardo da apoptose e a imunossupressão dos subtipos de neutrófilos da SDRA, e tem o potencial de desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento da SDRA.

2. As etapas experimentais são as seguintes:

1. Amostras de sangue periférico de pacientes com SDRA foram coletadas para detectar marcadores inflamatórios;
2. Os neutrófilos foram isolados do sangue periférico de pacientes com SDRA;
3. A proporção de subtipos de neutrófilos foi detectada por citometria de fluxo, e os subtipos de neutrófilos foram isolados;
4. Os subtipos de neutrófilos foram co-cultivados com linfócitos T do sangue periférico para detectar sua capacidade de inibir a proliferação de células T e a apoptose dos subtipos de neutrófilos;
5. Neutrófilos do sangue periférico e diferentes doses de derivados de glicina ginsenosídeo em pacientes com SDRA (2050100 μm) Após incubação por 20h, a taxa de apoptose foi de 28h.
6. Bax, Mcl-1 e caspase-3 clivada foram detectados por Western blot.
7. PCR de alto rendimento e mapp-4 foram usados ​​para detectar a expressão de genes relacionados à apoptose na via akg38k.
8. Análise metabolômica: coletar sangue periférico de pacientes com SDRA para análise metabolômica.

3. Métodos de pesquisa

1. Critérios diagnósticos: consulte o padrão de Berlim de 2012 para os critérios diagnósticos de SDRA.
2. Critérios de inclusão: (1) idade ≥ 18 anos; (2) Diagnóstico de lesão pulmonar aguda em 24 horas (critério de diagnóstico de Berlim para lesão pulmonar aguda)
3. Critérios de exclusão: (1) idade < 18 anos; (2) Alta ou óbito dentro de 48 horas após a admissão; (3) Gravidez ou puerpério; (4) Pacientes com imunossupressão.

4. Procedimento de teste

1. Métodos: Foram selecionados pacientes de UTI que atenderam aos critérios de inclusão
2. Processo de consentimento informado: assinar o termo de consentimento informado após comunicação com o paciente ou representante legal

5. Início e término do experimento O consentimento informado foi assinado em janeiro de 2020

6. Segurança de dados e plano de monitoramento Os prontuários do paciente (prontuários de estudo / CRF, formulários de exames, etc.) serão mantidos integralmente no hospital. O médico registrará os resultados dos exames laboratoriais e outros exames em seu prontuário. Os pesquisadores, o comitê de ética e a administração do medicamento terão acesso ao seu prontuário. Nenhum relatório público sobre os resultados do estudo revelará a identidade individual do paciente. Faremos todos os esforços para proteger as informações do paciente na medida permitida por lei. De acordo com a ética da pesquisa médica, exceto para informações de privacidade pessoal, dados experimentais estarão disponíveis para consulta e compartilhamento públicos, e a consulta e compartilhamento serão limitados ao banco de dados eletrônico baseado na rede para garantir que nenhuma informação de privacidade pessoal seja divulgada.

7. Cumprir os princípios éticos e as leis e regulamentos relevantes A participação ou não no estudo depende inteiramente da vontade dos pacientes e de seus representantes legais. Os pacientes e suas famílias podem se recusar a participar do estudo ou retirar-se do estudo a qualquer momento durante o curso do estudo. Isso não afetará o relacionamento entre o paciente e seu médico, nem afetará a perda de benefícios médicos ou outros para o paciente.

8. Plano de análise estatística O software SPSS15.0 foi usado para análise estatística. Os dados das medidas foram expressos como média ± desvio padrão, teste t ou teste não paramétrico foi usado para comparação entre os grupos, teste do qui-quadrado foi usado para contagem de dados e análise de correlação linear foi usada para a relação entre as variáveis, P < 0,05 foi considerado como estatisticamente significante.