Mecanismo de apoptosis retardada de neutrófilos en lesión pulmonar aguda

1. Bases bibliográficas El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es un síndrome clínico caracterizado por dificultad respiratoria e hipoxemia progresiva, causada por edema intersticial pulmonar y alveolar difuso causado por diversos factores pulmonares y extrapulmonares distintos de los factores cardiogénicos. La tasa de incidencia de ARDS es tan alta como 75/10 000 por año, y la sepsis y la infección pulmonar son las causas más comunes. En el pasado, generalmente se creía que la activación inmunitaria excesiva es el núcleo de la fisiopatología del SDRA, y se reconoce que los neutrófilos son el factor principal de la hiperactividad inflamatoria y la lesión pulmonar en el SDRA. Aunque se han logrado algunos avances en la epidemiología, patogenia y fisiopatología del SDRA en los últimos 50 años, y los resultados clínicos de algunos pacientes con SDRA han mejorado al optimizar el modo de ventilación mecánica y el tratamiento con fluidos, así como la ventilación prono y el uso de relajantes musculares, el ARDS sigue siendo una de las causas más comunes de muerte y discapacidad en las unidades de cuidados intensivos. La tasa de mortalidad de la enfermedad es actualmente del 30 al 40%. Todavía faltan fármacos efectivos para el tratamiento del SDRA en la clínica, e incluso los glucocorticoides aplicados para la sobreactivación inmunitaria no han logrado buenos resultados. Esto está relacionado con la patogenia poco clara del ARDS. Por lo tanto, todavía es un punto candente y difícil explorar más a fondo la patogenia y la progresión del SDRA y encontrar nuevos objetivos terapéuticos.

En el pasado, los PMN maduros en la sangre periférica generalmente se consideraban células funcionales en la etapa final, pero están ampliamente involucrados en diferentes respuestas inmunes innatas (incluyendo inflamación, infección, tumor, autoinmunidad, etc.) y pueden adoptar efectores muy diferentes. mecanismos Por ello, con la profundización de las investigaciones, en los últimos años se han identificado subtipos de neutrófilos con diferentes funciones (como la regulación y reparación inmunitarias): cd16dimcd62lbrightpmn y cd16brightcd62ldimmpmn. En el estado de equilibrio de las personas sanas, los neutrófilos maduros clásicos (cd16brightcd62lbright) en la sangre periférica representan más del 98 % del total de PMN, y la proporción de los dos subtipos de neutrófilos es relativamente baja. En el estado inflamatorio, la proporción de neutrófilos cd16dimcd62lbright y cd16brightcd62ldim aumentó significativamente. El análisis proteómico mostró que había diferencias significativas entre los dos subtipos de neutrófilos. El núcleo del subgrupo de neutrófilos cd16dimcd62lbright está en bandas, que se libera de la médula ósea después de ser estimulado por lipopolisacárido (LPS). Representa el 20% - 25% de PMN en sangre total en el modelo de infección por LPS. La tasa de apoptosis se reduce significativamente y los efectos bacteriostáticos, como el estallido oxidativo y la fagocitosis, aumentan significativamente; Por el contrario, el subgrupo de neutrófilos cd16brightcd62ldim tiene una capacidad antibacteriana reducida y muestra un fenotipo inmunosupresor. Es un subtipo de neutrófilo recién descubierto con función inmunosupresora en los últimos años, que puede inhibir la proliferación de células T, lo que está relacionado con la inmunosupresión en el modelo experimental de endotoxemia humana.

En nuestros estudios previos, hemos obtenido con éxito un nuevo aminoácido derivado del ginsenósido de ocotillol, que puede tener las actividades farmacológicas del ginsenósido de ocotillol y la glicina, y tiene un papel potencial en la mejora del retraso de la apoptosis y la inmunosupresión de los subtipos de neutrófilos del ARDS, y tiene el potencial del desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento del SDRA.

2. Los pasos experimentales son los siguientes:

1. Se recogieron muestras de sangre periférica de pacientes con SDRA para detectar marcadores inflamatorios;
2. Se aislaron neutrófilos de sangre periférica de pacientes con ARDS;
3. La proporción de subtipos de neutrófilos se detectó mediante citometría de flujo y se aislaron los subtipos de neutrófilos;
4. Los subtipos de neutrófilos se cocultivaron con linfocitos T de sangre periférica para detectar su capacidad para inhibir la proliferación de células T y la apoptosis de los subtipos de neutrófilos;
5. Neutrófilos de sangre periférica y diferentes dosis de derivados de glicina de ginsenósido en pacientes con SDRA (2050100 μ m) Después de 20 h de incubación, la tasa de apoptosis fue de 28 h.
6. Bax, Mcl-1 y caspasa-3 escindida se detectaron mediante Western blot.
7. Se utilizaron PCR de alto rendimiento y mapp-4 para detectar la expresión de genes relacionados con la apoptosis en la vía akg38k.
8. Análisis metabolómico: recolecte sangre periférica de pacientes con ARDS para análisis metabolómico.

3. Métodos de investigación

1. Criterios de diagnóstico: consulte el estándar de Berlín de 2012 para los criterios de diagnóstico de ARDS.
2. Criterios de inclusión: (1) edad ≥ 18 años; (2) Diagnóstico de lesión pulmonar aguda dentro de las 24 horas (criterios de diagnóstico de Berlín para lesión pulmonar aguda)
3. Criterios de exclusión: (1) edad < 18 años; (2) Alta o muerte dentro de las 48 horas posteriores a la admisión; (3) Embarazo o puerperio; (4) Pacientes con inmunosupresión.

4. Procedimiento de prueba

1. Métodos: Se seleccionaron pacientes de UCI que cumplían con los criterios de inclusión.
2. Proceso de consentimiento informado: firmar el formulario de consentimiento informado después de comunicarse con el paciente o representante legal

5. Inicio y finalización del experimento Se firmó el consentimiento informado en enero de 2020

6. Plan de vigilancia y seguridad de los datos La historia clínica del paciente (historia clínica del estudio/CRF, formularios de pruebas, etc.) se conservará íntegramente en el hospital. El médico registrará los resultados de las pruebas de laboratorio y otros exámenes en su historia clínica. Los investigadores, el comité de ética y la administración de medicamentos tendrán acceso a sus registros médicos. Ningún informe público sobre los resultados del estudio revelará la identidad individual del paciente. Haremos todo lo posible para proteger la información del paciente en la medida permitida por la ley. De acuerdo con la ética de la investigación médica, a excepción de la información de privacidad personal, los datos experimentales estarán disponibles para la consulta y el intercambio públicos, y la consulta y el intercambio se limitarán a la base de datos electrónica basada en la red para garantizar que no se divulgue información de privacidad personal.

7. Cumplir con los principios éticos y las leyes y reglamentos pertinentes La participación o no en el estudio depende enteramente de los deseos de los pacientes y sus representantes legales. Los pacientes y sus familias pueden negarse a participar en el estudio o retirarse del estudio en cualquier momento durante el curso del estudio. Esto no afectará la relación entre el paciente y su médico, ni afectará la pérdida de beneficios médicos o de otro tipo para el paciente.

8. Plan de análisis estadístico Se utilizó el software SPSS15.0 para el análisis estadístico. Los datos de medición se expresaron como media ± desviación estándar, se utilizó la prueba t o prueba no paramétrica para la comparación entre grupos, la prueba de chi cuadrado para el conteo de datos y el análisis de correlación lineal para la relación entre variables, se consideró P < 0.05 como Estadísticamente significante.