Autologní buněčný štěp v chirurgické léčbě vitiliga

Před operací budou vybrány dvě srovnatelné léze.

Léze budou hodnoceny na:

1. Plocha povrchu pomocí techniky počítání bodů.
2. Jakékoli pokusy o pigmentaci pomocí skóre VESTA. Léze budou dermatizovány v lokální anestezii pomocí frakčního laserového CO2 resurfacingu. Použití dot mode off resurfacingu bude prováděno při výkonu 18-20 W, doba prodlevy 1 000 milisekund (DEKA, Florencie, Itálie). Provede se jeden až tři průchody, dokud nebude epidermis rovnoměrně odstraněna.

Suspenze autologních buněčných mikroštěpů (ACM) vytvořená technikou regenera V lokální anestezii bude 2,5mm biopsie použita k extrakci 3 vzorků tkáně skalpu z pacientova týlního hrbolu za uchem pomocí lékařského zařízení Rigeneracons (certifikace CE třídy I; Human Brain Wave , Turín, Itálie). Odebrané vzorky budou umístěny do Rigeneracons přidáním 1,5 ml sterilního fyziologického roztoku do zařízení. Zařízení poté generuje buněčnou suspenzi rotací Rigeneraconů při 80 otáčkách za minutu po dobu 2 minut. Následně se získaná suspenze zředí dalšími 3 ml sterilního fyziologického roztoku. Výsledná suspenze se přidá k peletě melanocytů vytvořené technikou NCE a nanese se na jednu z derma bradovaných vitiliginózních náplastí.

Nekultivovaná epidermální suspenze (NCES):

Připraví se peleta keratinocytů melanocytů. Kůže dárce bude odebrána z gluteální oblasti po anestetizaci oblasti intralezionálním Mepicainem L; pomocí sterilní holicí čepelky upevněné na Kocherových kleštích. Expanzní poměr 1:2 byl použit pro každou lézi zvlášť, aby byla zajištěna ekvivalentní koncentrace melanocytů ve všech transplantovaných lézích. Buněčná suspenze se připraví umístěním kůže dárce do 0,25% roztoku trypsin-EDTA (GIBCO) na 40 minut při 37 °C. Každý vzorek a trypsin se nalije do označených Petriho misek a poté se neutralizují pomocí Ringerova laktátu. Všechny kroky budou prováděny na lavici s laminárním prouděním vzduchu za přísných aseptických podmínek. Pokožka bude oddělena od dermis, která bude odstraněna. Poté se epidermis nařeže na malé kousky a sešrotuje, aby na povrchu nezůstal žádný pigment. Poté budou přeneseny do dvou označených sterilních zkumavek Falcon a centrifugovány po dobu 10 minut při 1000 ot./min. Plovoucí epidermální fragmenty a supernatantová tekutina budou odstraněny, přičemž na dně zůstane buněčná peleta obsahující epidermální buňky bohaté na melanocyty a keratinocyty. Výsledná peleta bude jednou suspendována v ACM vytvořeném technikou regenera, jednou v suspenzi vlasových folikulů a jednou v 1 ml Ringerova laktátu.

Folikulární buněčná suspenze:

• V lokální anestezii se použije 1 mm děrovač k extrakci vlasových folikulů z okcipitální pokožky hlavy za uchem. V závislosti na oblasti, která má být transplantována, bude na každý 1 cm2 extrahován jeden pigmentovaný folikul. Extrahované vlasové folikuly se asi třikrát promyjí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS). Vlasové folikuly se potom inkubují s 0,25% trypsinem - 0,05% ethylendiamintetraoctovou kyselinou (EDTA) při 37 °C po dobu 60 minut rozdělených do 3 intervalů, aby se připravila suspenze jednotlivých buněk. První interval trval 30 minut, poté byl supernatant obsahující oddělené buňky nalit do nové Falconovy zkumavky a neutralizován 1% fetálním bovinním sérem. Čerstvý trypsin byl poté přidán do vlasových folikulů a reinkubován po dobu 15 minut dvakrát.
• Na konci tří takových cyklů zůstane tenký keratinový dřík. Buněčné suspenze ze všech zkumavek se přidají do jedné zkumavky. Konečná buněčná peleta se získá odstředěním spojené buněčné suspenze při 1000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut. Výsledná suspenze bude přidána k peletě melanocytů vytvořené technikou NCE a bude rozprostřena na srovnatelné dermatizované léze.

Výsledná suspenze bude zkontrolována na počet melanocytů a životaschopnost s použitím metody vylučování barviva trypanovou modří, aby se zajistilo více než 250 životaschopných buněk/mm2 plochy příjemce před jejím nanesením na derma bradovanou náplast na vitiligo.

Obě místa budou pokryta suchou kolagenovou fólií a následně sterilní chirurgickou podložkou a tegadermem.

Oblast bude po převázání znehybněna a pacientovi doporučeno omezení pohybu na operovaném místě.

Pacienti zahájí týdenní léčbu antibiotiky. Obvazy budou odstraněny po 1 týdnu a pacienti dostanou sezení excimerovým laserem, 3 sezení týdně po dobu 3 měsíců.

Pacienti budou sledováni měsíčně po dobu 3 měsíců po první návštěvě v 1 týdnu.

Po 3 měsících bude provedeno kvalitativní i kvantitativní hodnocení. Kvalitativně bude provedeno hodnocení repigmentace a shody barev zaslepeným lékařem pomocí sériových fotografií. Kvantitativně bude k posouzení stupně repigmentace také použita metoda počítání bodů a VESTA skóre.