Autologiczny przeszczep komórkowy w chirurgicznym leczeniu bielactwa

Przed operacją zostaną wybrane dwie porównywalne zmiany.

Zmiany zostaną ocenione pod kątem:

1. Powierzchnia przy użyciu techniki liczenia punktów.
2. Wszelkie próby pigmentacji w skali VESTA. Zmiany skórne zostaną wycięte w znieczuleniu miejscowym przy użyciu lasera frakcyjnego CO2 resurfacing. Resurfacing w trybie punktowym zostanie wykonany przy mocy 18-20 W, czas przebywania 1000 milisekund (DEKA, Florencja, Włochy). Wykonuje się od jednego do trzech przejść, aż do równomiernego usunięcia naskórka.

Zawiesina autologicznych mikroprzeszczepów komórkowych (ACM) wytworzona techniką regenera W znieczuleniu miejscowym zostanie pobrana 2,5-milimetrowa biopsja punktowa w celu pobrania 3 próbek tkanki skóry głowy z potylicy pacjenta za uchem, przy użyciu urządzenia medycznego Rigeneracons (certyfikat CE klasa I; Human Brain Wave) , Turyn, Włochy). Pobrane próbki zostaną umieszczone w Rigeneracons poprzez dodanie do urządzenia 1,5 ml sterylnego roztworu fizjologicznego. Następnie urządzenie wytwarza zawiesinę komórkową przez obracanie Rigeneraconów przy 80 obrotach na minutę przez 2 minuty. Następnie otrzymaną zawiesinę rozcieńcza się dodatkowymi 3 ml sterylnego roztworu fizjologicznego. Powstała zawiesina zostanie dodana do peletki melanocytów wytworzonej techniką NCES i rozprowadzona na jednym z plastrów bielactwa skórnego.

Zawiesina naskórka bez hodowli (NCES):

Zostanie przygotowany osad keratynocytów melanocytów. Skóra dawcy zostanie pobrana z okolicy pośladkowej po znieczuleniu tego obszaru mepicainą L w obrębie zmiany chorobowej; przy użyciu sterylnego ostrza do golenia zamocowanego na szczypcach Kochera. Stosunek ekspansji 1:2 zastosowano oddzielnie dla każdej zmiany, aby zapewnić równoważne stężenie melanocytów we wszystkich przeszczepionych zmianach. Zawiesina komórek zostanie przygotowana poprzez umieszczenie skóry dawcy w 0,25% roztworze trypsyny-EDTA (GIBCO) na 40 minut w temperaturze 37°C. Każdą próbkę i trypsynę wlewa się do oznakowanych szalek Petriego, a następnie neutralizuje mleczanem Ringera. Wszystkie etapy zostaną przeprowadzone na stanowisku z laminarnym przepływem powietrza w ściśle aseptycznych warunkach. Naskórek zostanie oddzielony od skóry właściwej, która zostanie wyrzucona. Następnie naskórek zostanie pocięty na drobne kawałki i zeskrobany, tak aby na powierzchni nie pozostał żaden pigment. Następnie zostaną przeniesione do dwóch oznakowanych sterylnych probówek Falcon i wirowane przez 10 minut przy 1000 obr./min. Pływające fragmenty naskórka i supernatant zostaną usunięte, pozostawiając osad komórkowy zawierający komórki naskórka bogate w melanocyty i keratynocyty na dnie. Powstały osad zostanie zawieszony raz w ACM wytworzonym techniką regenera, raz w zawiesinie mieszków włosowych i raz w 1 ml mleczanu Ringera.

Zawiesina komórkowa mieszków włosowych:

• W znieczuleniu miejscowym 1-milimetrowy stempel zostanie użyty do usunięcia mieszków włosowych z potylicznej skóry głowy za uchem. W zależności od obszaru przeznaczonego do przeszczepu, z każdego 1 cm2 pobierany jest jeden pęcherzyk barwnikowy. Wyekstrahowane mieszki włosowe przemywa się solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) około 3 razy. Mieszki włosowe następnie inkubuje się z 0,25% trypsyną - 0,05% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w temperaturze 37°C przez 60 minut, z podziałem na 3 okresy w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek. Pierwsza przerwa trwała 30 minut, po czym supernatant zawierający oddzielone komórki wlewano do nowej probówki Falcon i neutralizowano 1% płodową surowicą bydlęcą. Następnie do mieszków włosowych dodawano świeżą trypsynę i ponownie inkubowano przez 15 minut dwukrotnie.
• Pod koniec trzech takich cykli pozostaje cienki wałek keratynowy. Zawiesiny komórkowe ze wszystkich probówek dodaje się w jednej probówce. Końcowy osad komórek otrzymuje się przez wirowanie połączonej zawiesiny komórek przy 1000 obr./min przez 5 min. Powstała zawiesina zostanie dodana do peletki melanocytów wytworzonej techniką NCES i rozprowadzona na porównywalnej zmianie skórnej.

Uzyskana zawiesina zostanie sprawdzona pod kątem liczby i żywotności melanocytów przy użyciu metody wykluczania barwnika z błękitem trypanu, aby upewnić się, że ponad 250 żywotnych komórek/mm2 obszaru biorcy przed jej rozprowadzeniem na plastrze bielactwa nabytego na skórze właściwej.

Oba miejsca zostaną pokryte suchym arkuszem kolagenu, a następnie sterylnym podkładem chirurgicznym i tegadermem.

Po zabandażowaniu okolica zostanie unieruchomiona, a pacjentowi zostanie zalecone ograniczenie ruchu w miejscu operowanym.

Pacjenci rozpoczną tygodniową kurację antybiotykową. Opatrunki zostaną usunięte po 1 tygodniu, a pacjenci otrzymają sesje laserem ekscymerowym, 3 sesje tygodniowo przez 3 miesiące.

Pacjenci będą obserwowani co miesiąc przez 3 miesiące od pierwszej wizyty po 1 tygodniu.

Po 3 miesiącach zostanie przeprowadzona zarówno ocena jakościowa, jak i ilościowa. Jakościowo, zaślepiona lekarz dokona oceny repigmentacji, a także dopasowania kolorów za pomocą zdjęć seryjnych. Ilościowo, do oceny stopnia repigmentacji wykorzystana zostanie również metoda zliczania punktów oraz punktacja VESTA.