Аутологичный клеточный трансплантат в хирургическом лечении витилиго

Перед операцией будут выбраны два сопоставимых поражения.

Поражения будут оцениваться по следующим параметрам:

1. Площадь поверхности с использованием метода подсчета точек.
2. Любые попытки пигментации по шкале VESTA. Поражения будут обработаны дермой под местной анестезией с использованием фракционной лазерной шлифовки CO2. Точечная шлифовка будет выполняться при мощности 18-20 Вт, время выдержки 1000 миллисекунд (DEKA, Флоренция, Италия). Будет выполнено от одного до трех проходов, пока эпидермис не будет удален равномерно.

Суспензия аутологичных клеточных микротрансплантатов (ACM), полученная методом регенерации. Под местной анестезией будет использована пункционная биопсия 2,5 мм для извлечения 3 образцов ткани кожи головы пациента из затылочной области за ухом с использованием медицинского устройства Rigeneracons (сертифицированный CE класс I; Human Brain Wave , Турин, Италия). Собранные образцы помещают в ригенераконы, добавляя в устройство 1,5 мл стерильного физиологического раствора. Затем устройство создает клеточную суспензию путем вращения Rigeneracons со скоростью 80 об/мин в течение 2 минут. Затем полученную суспензию разбавляют дополнительными 3 мл стерильного физиологического раствора. Полученная суспензия будет добавлена ​​к осадку меланоцитов, полученному методом NCES, и будет нанесена на один из витилигинозных участков, связанных с дермой.

Некультивируемая эпидермальная суспензия (NCES):

Будет приготовлен осадок кератиноцитов меланоцитов. Донорская кожа будет взята из ягодичной области после анестезии области внутриочаговым введением мепикаина L; с помощью стерильного бритвенного лезвия, закрепленного на щипцах Кохера. Коэффициент расширения 1:2 использовали для каждого поражения отдельно, чтобы обеспечить эквивалентную концентрацию меланоцитов во всех трансплантированных поражениях. Клеточная суспензия будет приготовлена ​​путем помещения донорской кожи в 0,25% раствор трипсина-ЭДТА (GIBCO) на 40 минут при 37 °C. Каждый образец и трипсин будут вылиты в маркированные чашки Петри, а затем нейтрализованы лактатом Рингера. Все этапы будут выполняться на стенде с ламинарным потоком воздуха в строгих асептических условиях. Эпидермис будет отделен от дермы, которая будет отброшена. Затем эпидермис нарезают на мелкие кусочки и соскабливают, чтобы на поверхности не осталось пигмента. После этого их переносят в две маркированные стерильные пробирки Falcon и центрифугируют в течение 10 минут при 1000 об/мин. Плавающие фрагменты эпидермиса и супернатант удаляют, оставляя на дне клеточный осадок, содержащий эпидермальные клетки, богатые меланоцитами и кератиноцитами. Полученный осадок суспендируют один раз в ACM, полученном методом регенерации, один раз в суспензии волосяных фолликулов и один раз в 1 мл лактата Рингера.

Фолликулярная клеточная суспензия:

• Под местной анестезией 1-миллиметровый перфоратор будет использоваться для извлечения волосяных фолликулов из затылочной части головы за ухом. В зависимости от области, подлежащей пересадке, из каждого 1 см2 будет извлечен один пигментированный фолликул. Извлеченные волосяные фолликулы промывают фосфатно-солевым буфером (PBS) примерно 3 раза. Затем волосяные фолликулы инкубируют со смесью 0,25% трипсина и 0,05% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при 37°С в течение 60 мин, разделенных на 3 интервала, для приготовления суспензии отдельных клеток. Первый интервал длился 30 минут, после чего надосадочную жидкость, содержащую отделившиеся клетки, сливали в новую пробирку Falcon и нейтрализовали 1% эмбриональной бычьей сывороткой. Затем к волосяным фолликулам добавляли свежий трипсин и повторно инкубировали в течение 15 минут дважды.
• По окончании трех таких циклов остается тонкий ороговевший стержень. Клеточную суспензию из всех пробирок добавляют в одну пробирку. Конечный клеточный осадок получают центрифугированием объединенной клеточной суспензии при 1000 об/мин в течение 5 мин. Полученная суспензия будет добавлена ​​к осадку меланоцитов, полученному с помощью метода NCES, и будет нанесена на сопоставимое поражение дермы.

Полученную суспензию проверяют на количество меланоцитов и их жизнеспособность с использованием метода исключения красителя трипанового синего, чтобы обеспечить более 250 жизнеспособных клеток/мм2 реципиентной области перед ее распространением на пластыре витилиго с дермой.

Оба участка будут покрыты сухим коллагеновым листом, а затем стерильной хирургической прокладкой и тегадермом.

Область будет иммобилизована после перевязки, и пациенту будет рекомендовано ограничить движение в прооперированном месте.

Пациенты начнут 1-недельный курс антибиотиков. Повязки будут удалены через 1 неделю, и пациенты будут получать сеансы эксимерного лазера, 3 сеанса в неделю в течение 3 месяцев.

Пациенты будут наблюдаться ежемесячно в течение 3 месяцев после первого визита через 1 неделю.

Через 3 месяца будет проведена как качественная, так и количественная оценка. Будет проведена качественная слепая врачебная оценка репигментации, а также соответствия цвета с использованием серийных фотографий. Количественно, метод подсчета баллов, а также оценка VESTA также будут использоваться для оценки степени репигментации.