Autologes Zelltransplantat bei der chirurgischen Behandlung von Vitiligo

Vor der Operation werden zwei vergleichbare Läsionen ausgewählt.

Läsionen werden beurteilt auf:

1. Oberfläche unter Verwendung der Punktzähltechnik.
2. Alle Pigmentierungsversuche mit dem VESTA-Score. Die Läsionen werden unter örtlicher Betäubung mit fraktioniertem Laser-CO2-Resurfacing dermabradiert. Das Resurfacing im Dot-Modus wird mit einer Leistung von 18-20 W und einer Verweilzeit von 1.000 Millisekunden durchgeführt (DEKA, Florenz, Italien). Ein bis drei Durchgänge werden durchgeführt, bis die Epidermis gleichmäßig entfernt ist.

Autologe zelluläre Mikrotransplantat-Suspension (ACM), die durch die Regenera-Technik erzeugt wird. Unter örtlicher Betäubung wird eine 2,5-mm-Stanzbiopsie verwendet, um 3 Kopfhautgewebeproben aus dem Hinterkopf des Patienten hinter dem Ohr zu entnehmen, wobei Rigeneracons Medizinprodukt (CE-zertifiziert Klasse I; Human Brain Wave , Turin, Italien). Die gesammelten Proben werden in Rigeneracons platziert, indem 1,5 ml sterile physiologische Lösung in das Gerät gegeben werden. Das Gerät erzeugt dann eine Zellsuspension durch Rotation von Rigeneracons bei 80 U/min für 2 Minuten. Anschließend wird die erhaltene Suspension mit weiteren 3 ml steriler physiologischer Lösung verdünnt. Die resultierende Suspension wird zu einem Melanozytenpellet hinzugefügt, das durch die NCES-Technik erzeugt wurde, und wird auf einem der Derma-verzierten vitiliginösen Patches verteilt.

Nicht kultivierte epidermale Suspension (NCES):

Melanozyten-Keratinozyten-Pellet wird hergestellt. Spenderhaut wird aus der Gesäßregion entnommen, nachdem der Bereich mit intraläsionalem Mepicain L betäubt wurde; unter Verwendung einer sterilen Rasierklinge, die an einer Kocher-Zange befestigt ist. Ein Expansionsverhältnis von 1:2 wurde für jede Läsion separat verwendet, um eine äquivalente Melanozytenkonzentration in allen transplantierten Läsionen sicherzustellen. Die Zellsuspension wird hergestellt, indem die Spenderhaut 40 Minuten lang bei 37 °C in 0,25 % Trypsin-EDTA (GIBCO)-Lösung gelegt wird. Jede Probe und Trypsin werden in eine beschriftete Petrischale gegossen und dann mit Ringerlaktat neutralisiert. Alle Schritte werden in einer Laminar-Air-Flow-Bank unter streng aseptischen Bedingungen durchgeführt. Die Epidermis wird von der Dermis abgelöst, die verworfen wird. Dann wird die Epidermis in winzige Stücke geschnitten und verschrottet, damit kein Pigment auf der Oberfläche zurückbleibt. Anschließend werden sie in zwei beschriftete sterile Falcon-Röhrchen überführt und 10 Minuten bei 1.000 U/min zentrifugiert. Die schwimmenden epidermalen Fragmente und die überstehende Flüssigkeit werden entfernt, wodurch das Zellpellet zurückbleibt, das epidermale Zellen enthält, die reich an Melanozyten und Keratinozyten am Boden sind. Das resultierende Pellet wird einmal in ACM, das durch die Regenera-Technik erzeugt wurde, einmal in Haarfollikelsuspension und einmal in 1 ml Ringerlaktat suspendiert.

Follikuläre Zellsuspension:

• Unter örtlicher Betäubung werden mit einer 1-mm-Stanze Haarfollikel aus der Hinterkopfhaut hinter dem Ohr entnommen. Abhängig von der zu transplantierenden Fläche wird ein pigmentierter Follikel pro 1 cm2 entnommen. Die extrahierten Haarfollikel werden etwa dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Haarfollikel werden dann mit 0,25 % Trypsin – 0,05 % Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37°C für 60 min, aufgeteilt in 3 Intervalle, inkubiert, um die Einzelzellsuspension herzustellen. Das erste Intervall dauerte 30 Minuten, wonach die überstehende Flüssigkeit, die abgetrennte Zellen enthielt, in ein neues Falkenröhrchen gegossen und mit 1 % fötalem Rinderserum neutralisiert wurde. Frisches Trypsin wurde dann zu den Haarfollikeln gegeben und zweimal für 15 Minuten erneut inkubiert.
• Am Ende von drei solchen Zyklen bleibt ein dünner Keratinschaft zurück. Die Zellsuspensionen aller Röhrchen werden in ein einziges Röhrchen gegeben. Das endgültige Zellpellet wird durch 5-minütiges Zentrifugieren der vereinigten Zellsuspension bei 1000 U/min erhalten. Die resultierende Suspension wird zu einem durch NCES-Technik erzeugten Melanozytenpellet hinzugefügt und auf einer vergleichbaren dermalen Läsion verteilt.

Die resultierende Suspension wird unter Verwendung der Trypanblau-Farbstoff-Ausschlussmethode auf Melanozytenzahl und Lebensfähigkeit überprüft, um sicherzustellen, dass über 250 lebensfähige Zellen/mm2 des Empfängerbereichs vorhanden sind, bevor sie auf dem Derma-Braded-Vitiligo-Pflaster verteilt wird.

Beide Stellen werden mit einem trockenen Kollagenblatt bedeckt, gefolgt von einem sterilen chirurgischen Pad und Tegaderm.

Der Bereich wird nach der Bandagierung immobilisiert und der Patient wird angewiesen, die Bewegung an der operierten Stelle einzuschränken.

Die Patienten beginnen mit einer 1-wöchigen Antibiotikakur. Die Verbände werden nach 1 Woche entfernt und die Patienten erhalten Excimer-Laser-Sitzungen, 3 Sitzungen pro Woche für 3 Monate.

Die Patienten werden monatlich für 3 Monate nach dem ersten Besuch bei 1 Woche nachuntersucht.

Nach 3 Monaten wird sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Bewertung durchgeführt. Qualitativ wird eine verblindete ärztliche Beurteilung der Repigmentierung sowie der Farbübereinstimmung anhand von Serienfotos durchgeführt. Quantitativ werden sowohl die Punktzählmethode als auch der VESTA-Score verwendet, um den Grad der Repigmentierung zu beurteilen.