Innesto cellulare autologo nel trattamento chirurgico della vitiligine

Prima dell'intervento chirurgico, verranno selezionate due lesioni comparabili.

Le lesioni saranno valutate per:

1. Area di superficie utilizzando la tecnica del conteggio dei punti.
2. Eventuali tentativi di pigmentazione utilizzando il punteggio VESTA. Le lesioni saranno derma braded in anestesia locale utilizzando il resurfacing laser CO2 frazionato, utilizzando la modalità dot off il resurfacing sarà eseguito a una potenza di 18-20 W, tempo di permanenza 1.000 millisecondi (DEKA, Firenze, Italia). Verranno eseguiti da uno a tre passaggi fino a quando l'epidermide non viene rimossa in modo uniforme.

Sospensione di microinnesti cellulari autologhi (ACM) generata mediante tecnica regenera In anestesia locale, verrà utilizzata una biopsia punch da 2,5 mm per estrarre 3 campioni di tessuto del cuoio capelluto dall'occipite del paziente dietro l'orecchio, utilizzando il dispositivo medico Rigeneracons (certificato CE classe I; Human Brain Wave , Torino, Italia). I campioni raccolti verranno inseriti in Rigeneracons aggiungendo al dispositivo 1,5 mL di soluzione fisiologica sterile. Il dispositivo genera quindi una sospensione cellulare mediante rotazione di Rigeneracons a 80 RPM per 2 minuti. Successivamente, la sospensione ottenuta viene diluita con un'ulteriore soluzione fisiologica sterile da 3 mL. La sospensione risultante verrà aggiunta al pellet di melanociti generato con la tecnica NCES e verrà spalmata su una delle placche vitiliginose derma braded.

Sospensione epidermica non coltivata (NCES):

Verrà preparato pellet di cheratinociti di melanociti. La pelle del donatore verrà prelevata dalla regione glutea dopo aver anestetizzato l'area con Mepicaina L intralesionale; utilizzando una lama da barba sterile montata su una pinza di Kocher. Un rapporto di espansione di 1:2 è stato utilizzato per ciascuna lesione separatamente per garantire una concentrazione di melanociti equivalente in tutte le lesioni trapiantate. La sospensione cellulare sarà preparata ponendo la pelle del donatore in una soluzione allo 0,25% di tripsina-EDTA (GIBCO) per 40 minuti a 37 ᴼC. Ogni campione e tripsina saranno versati in una capsula di Petri etichettata e poi neutralizzati utilizzando il lattato di suoneria. Tutte le fasi saranno eseguite in un banco a flusso d'aria laminare in condizioni rigorosamente asettiche. L'epidermide si staccherà dal derma che verrà scartato. Quindi l'epidermide verrà tagliata in piccoli pezzi e scartata in modo che non rimanga alcun pigmento sulla superficie. Successivamente, saranno trasferiti in due provette Falcon sterili etichettate e centrifugate per 10 minuti a 1.000 rpm. I frammenti epidermici galleggianti e il liquido supernatante verranno rimossi, lasciando sul fondo il pellet cellulare contenente cellule epidermiche ricche di melanociti e cheratinociti. Il pellet risultante sarà sospeso una volta in ACM generato con la tecnica regenera, una volta in sospensione del follicolo pilifero e una volta in 1 ml di ringer lattato.

Sospensione cellulare follicolare:

• In anestesia locale, verrà utilizzato un punch da 1 mm per estrarre i follicoli piliferi dal cuoio capelluto occipitale dietro l'orecchio. A seconda dell'area da trapiantare, verrà estratto un follicolo pigmentato per ogni 1 cm2. I follicoli piliferi estratti vengono lavati con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per circa 3 volte. I follicoli piliferi vengono quindi incubati con tripsina 0,25% - acido etilendiamminotetracetico (EDTA) 0,05% a 37°C per 60 minuti suddivisi in 3 intervalli per preparare la sospensione unicellulare. Il primo intervallo è durato 30 minuti, dopodiché il liquido supernatante contenente le cellule separate è stato versato in una nuova provetta di falco e neutralizzato dall'1% di siero bovino fetale. La tripsina fresca è stata quindi aggiunta ai follicoli piliferi e reincubata per 15 minuti due volte.
• Alla fine di tre di questi cicli, viene lasciato un sottile fusto cheratinico. Le sospensioni cellulari di tutti i tubi vengono aggiunte in un unico tubo. Il pellet cellulare finale si ottiene centrifugando la sospensione cellulare combinata a 1000 rpm per 5 min. La sospensione risultante sarà aggiunta al pellet di melanociti generato con la tecnica NCES e sarà spalmata su una lesione derma braded comparabile.

La sospensione risultante verrà controllata per il conteggio e la vitalità dei melanociti utilizzando il metodo di esclusione del colorante tripan blu per garantire oltre 250 cellule vitali/mm2 dell'area ricevente prima della sua diffusione sul cerotto per vitiligine derma braded.

Entrambi i siti saranno coperti con un foglio di collagene secco seguito da tampone chirurgico sterile e tegaderm.

L'area verrà immobilizzata dopo il bendaggio e al paziente verrà consigliato di limitare i movimenti nel sito operato.

I pazienti inizieranno un ciclo di antibiotici di 1 settimana. Le medicazioni verranno rimosse dopo 1 settimana e i pazienti riceveranno sessioni di laser ad eccimeri, 3 sessioni a settimana per 3 mesi.

I pazienti saranno seguiti mensilmente per 3 mesi dopo la prima visita a 1 settimana.

A 3 mesi, verrà effettuata una valutazione sia qualitativa che quantitativa. Qualitativamente, verrà eseguita una valutazione medica in cieco della ripigmentazione e della corrispondenza dei colori utilizzando fotografie seriali. Quantitativamente, verranno utilizzati anche il metodo del conteggio dei punti e il punteggio VESTA per valutare il grado di ripigmentazione.