Vliv pokročilého fibrinu bohatého na destičky a derivátu matrice skloviny na klinické a molekulární parametry hojení ran po chirurgickém odstranění mandibulárních třetích molárů

Chirurgické odstranění impaktovaných mandibulárních zubů moudrosti často souvisí s výskytem pooperační bolesti, otoku, trismu a někdy i s rozvojem komplikací, jako je alveolární osteitida, opožděná infekce a tvorba parodontální kapsy na distální ploše druhého moláru. Aby se snížilo pooperační nepohodlí a komplikace, jsou běžně předepisovány nesteroidní protizánětlivé léky a antibiotika.

Umístění autologních materiálů a komerčně dostupných produktů do extrakčních alveolů, aby se minimalizovala pooperační bolest, otok, trismus a komplikace, je možnost terapie, která je diskutována v literatuře.

Fibrin bohatý na krevní destičky (PRF) je autologní fibrin získaný z pacientovy žilní krve bohaté na krevní destičky, leukocyty, růstové faktory a cytokiny. Advanced PRF (APRF) je varianta PRF, která se vyrábí menší rychlostí odstřeďování a menší relativní odstředivou silou po delší dobu ve srovnání s jinými typy sraženin PRF. APRF obsahuje leukocyty, vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), transformující růstový faktor β (TGF-β), interleukin -1β (IL1β) a interleukin-6 (IL6).

Lokální aplikace APRF do extrakčního alveolu po chirurgickém odstranění impaktovaných mandibulárních zubů moudrosti prokázala pozitivní účinky, jako je menší pooperační bolestivost, lepší hojení měkkých tkání a nižší výskyt alveolární osteitidy a opožděné infekce.

Studie in vitro ukázaly, že PRF obsahuje významná množství VEGF, TGF-β, IL1β, IL6. Studie in vitro také ukázala, že PRF indukuje polymeraci prozánětlivých makrofágů M1 na protizánětlivé makrofágy M2. Makrofágy M2 produkují specializované pro-rozlišovací lipidové mediátory, které jsou důležité pro fázi řešení zánětlivého procesu a hojení ran. Maresin 1 (MaR1), specializovaný pro-rozlišovací lipidový mediátor, prokázal důležitou roli při navození rychlejšího hojení měkkých tkání a kostí, a proto může být přítomnost tohoto mediátoru relevantní pro indikaci průběhu pooperačního hojení ran. Vezmeme-li v úvahu data z klinických studií a studií in vitro, bylo by přínosné stanovit na klinickém modelu, jako je chirurgické odstranění zasažených mandibulárních zubů moudrosti, hladiny VEGF, TGF-β, IL1β, IL6 a MaR1 po umístění APRF do extrakce alveolu ve srovnání se standardním chirurgickým odstraněním impaktovaných mandibulárních zubů moudrosti a porovnat tyto hladiny s klinickými parametry pooperačního průběhu.

Derivát matrice zubní skloviny (EMD) obsahuje proteiny matrice zubní skloviny amelogeniny extrahované z šestiměsíčních selat. Buňky Hertwigovy epiteliální kořenové pochvy uvolňují na povrchu kořene před tvorbou cementu převážně amelogeniny a tyto proteiny jsou iniciačním faktorem cementogeneze během odontogeneze. Studie in vitro ukázaly, že buňky periodontálního vazu vystavené EMD produkují TGF-β a IL6. Podobná studie ukázala, že exprese IL1β byla významně nižší po expozici buněk parodontálního vazu EMD. Klinické a in vitro studie ukázaly, že EMD stimuluje angiogenezi tím, že indukuje lidské mikrovaskulární endoteliální buňky k produkci VEGF. Pozitivní vliv EMD na periodontální defekty je prokázán mnoha klinickými studiemi.

Pokud jde o klinické a in vitro studie, významné hladiny VEGF, TGF-β, IL1β, IL6 po umístění EMD by v klinickém modelu chirurgického odstranění impaktovaných zubů moudrosti mohly naznačovat lepší hojení ran, parodontální parametry druhého moláru a menší pooperační diskomfort a komplikace . V literatuře nejsou žádné informace o potenciálním vlivu EOM na produkci Mar1.

Primárním cílem výzkumu bude zhodnotit a porovnat lokální zánětlivou odpověď a hojení měkkých tkání mezi skupinami, kde byly umístěny APRF nebo EMD a standardní chirurgické odstranění impaktovaných mandibulárních zubů moudrosti stanovením a porovnáním hladin IL6, IL1β, Mar1, VEGF a TGF-p. Primárním cílem je také zhodnotit a porovnat úrovně pooperační bolesti, otoku, trismu a hojení měkkých tkání. Sekundárními cíli je zhodnotit výskyt alveolární osteitidy, opožděné infekce a rozvoje periodontální kapsy na distálním povrchu dolního druhého moláru a analyzovat mezi skupinami a zjistit, zda existuje korelace mezi klinickými a molekulárními parametry.

Prospektivní, randomizovaná, kontrolovaná studie s dvojitým rozdělením úst bude provedena na katedře ústní chirurgie a laboratoři základních věd, School of Dental Medicine, University of Belgrade, Srbsko. Výzkum bude proveden podle pokynů CONSORT podle Helsinské deklarace. Po splnění kritérií pro zařazení dostanou účastníci slovní a písemné informace o cílech studie, protokolu a také o možných rizicích a přínosech studie. Do studie budou zařazeni pouze způsobilí subjekty, které souhlasí s poskytnutými informacemi a podepíší formulář informovaného souhlasu. Celkem bude zahrnuto 60 pacientů (120 operací) s bilaterálně zasaženými zuby moudrosti dolní čelisti. Počítačově generovaná blokovaná randomizace s alokačním poměrem 1:1 (velikost bloku 4) bude provedena výzkumníkem nezařazeným do studie (Microsoft Excel, verze 2016). Pro utajení přidělení budou papíry obsahující kód přidělené skupiny (skupina 1-APRF; skupina 2-EMD) vloženy do neprůhledných obálek a zalepeny. Hodinu před intervencí stejný nezávislý výzkumník rozlepí následující obálku. Po objevení experimentální skupiny (APRF nebo EMD) nezávislý výzkumník přidělí stranu čelisti kontrolní skupině nebo experimentální skupině hodem mincí.

Ve skupině APRF 15 minut před operací nezávislý výzkumník informuje pacienta, že bude provedena flebotomie, a instruuje flebotoma, aby provedl flebotomii. Hlavní řešitel nebude vědět o přidělení až do dokončení analýzy dat. Chirurg si bude vědom alokace vzhledem k povaze zásahu.

Kritériem pro zařazení do studie jsou systémově zdraví pacienti, kteří mají bilaterálně postižené mandibulární zuby moudrosti, které jsou v kontaktu s distálním povrchem druhého mandibulárního moláru.

Věk (roky), pohlaví a kuřácký status (nekouří, ≤10/den nebo >10/den) budou získány od pacientů, kteří splnili kritéria pro zařazení. Na stejnou schůzku (první studijní schůzka) budou oba chirurgické zákroky naplánovány s odstupem alespoň tří týdnů. Poloha třetího moláru bude odhadnuta na panoramatických rentgenových snímcích podle klasifikace Pell a Gregory a Winter. Vstupní vyšetření, perioperační, intraoperační a následná měření provede jeden zaslepený klinik.

Odběr gingivální křevikální tekutiny na distální ploše druhého moláru dolní čelisti, základní měření maximálního meziřezáku a vzdáleností tragusorální komisury, úhlu vnějšího koutku mandibuly na straně extrakce a periodontální měření druhého moláru dolní čelisti být proveden při druhé schůzce studie, těsně před operací. Periodontální mapování bude provedeno ve třech bodech bukálně a ve třech následujících bodech, mediální distální, lingvální distální, mediální lingvální bod.

Po regionálních dolních alveolárních, lingválních a bukálních nervových blokádách lokálním anestetickým roztokem sestávajícím ze 4% articain hydrochloridu s 1:100 000 adrenalinem (Septanest®, Septodont, Saint-Maur-des-Fosses, Francie), chirurgické odstranění impaktovaných mandibulární třetí molár bude proveden podle techniky dříve popsané v literatuře: po elevaci chlopně v plné tloušťce se provede odstranění kosti rotačními nástroji za sterilního proplachu fyziologickým roztokem. K extrakci zubu budou použity elevátory a kleště a v případě potřeby bude provedena separace zubů. Po extrakci zubu a vyhlazení okrajů kosti budou ve skupině APRF umístěny dvě APRF sraženiny do alveolu a ve skupině EMD bude povrch distálního kořene druhého moláru ošetřen 24% EDTA ((PrefGel®, Straumann) pro dva minut, poté se zavlažuje a EMD (Emdogain®, Straumann) se umístí v kombinaci s kolagenovou houbou (Collacone®, Botiss). Rána bude sešita polypropylenovým šicím materiálem 4-0 se speciální poznámkou k umístění prvních dvou následujících stehů v retromolární oblasti ve vzdálenosti 5 mm, aby bylo možné odebírat exsudát z rány umístěním papírových bodů do rány při sledování.

V kontrolních skupinách po extrakci zubu a vyhlazení okrajů kostí bude primární sutura okamžitě umístěna se stejnou poznámkou, která byla zmíněna výše.

Všechny chirurgické zákroky bude provádět jeden zkušený ústní chirurg. Intraoperačně bude registrována doba trvání intervence (min), množství použitého roztoku lokálního anestetika (ml), separace zubů, pokud byla provedena, a případné intraoperační komplikace.

Pacientům budou podány tablety paracetamolu 500 mg ((Paracetamol®, Galenika, Bělehrad, Srbsko), které si odnesou domů, a předem navržený dotaz domů, který obsahuje pole pro registraci analgetika (pokaždé, když si vezmete, počet užitých pilulek a dávka) . Kromě toho budou pacienti instruováni, aby zaznamenávali intenzitu bolesti na vizuální analogové stupnici (VAS) a verbální hodnotící stupnici bolesti (VRS).

Při třetí schůzce ke studii (24 hodin po operaci) bude provedeno měření maximálního meziřezáku a vzdáleností tragusorální komisury, vnějšího úhlu koutku dolní čelisti na straně extrakce. Pacienti budou také požádáni, aby zhodnotili intenzitu bolesti při schůzce na VAS a VRS.

Při čtvrté studijní návštěvě (48h po operaci) bude provedeno měření maximálních meziřezáků a vzdáleností tragusorální komisura, úhel vnějšího koutku mandibuly na straně extrakce. Při této návštěvě bude také proveden odběr exsudátu z rány a pacienti budou znovu požádáni, aby zhodnotili úroveň své bolesti na VAS a VRS.

Při páté studijní návštěvě (7 dní po operaci) bude provedeno měření maximálních meziřezáků a vzdáleností tragus-orální komisura, zevní koutek-úhel mandibuly. Před odstraněním stehu bude také proveden odběr exsudátu z rány. Při této návštěvě pacienti přinesou zpět svůj dříve zadaný dotaz, který v průběhu týdne plnili.

Šestá studijní návštěva se uskuteční tři měsíce po operaci a provede se periodontální mapování.

Vzorky budou odebírány papírovými hroty (velikost #30, 28 mm dlouhé ISO standardizované hroty s úkosem 2 %) umístěnými v ráně po dobu 30 s. Byla by přijata opatření, aby se zabránilo kontaminaci papírových bodů slinami během odběru vzorků. Papírové body budou poté umístěny do sterilních plastových zkumavek, které jsou předem naplněny tekutinou, která zabraňuje RNA.

Budou provedeny laboratorní postupy s cílem posoudit úroveň relativní genové i proteinové exprese zánětlivých (IL6, IL1β, MAR1) a mediátorů časného hojení ran (VEGF, TGF-β) u testovaných skupin v různých časových bodech. Po izolaci RNA a získání komplementární DNA (podle pokynů výrobce) bude vyhodnocena relativní genová exprese IL6, IL1β, VEGF a TGF-β pomocí testu polymerázové řetězové reakce v reálném čase. Proteinová exprese MAR1 bude prováděna enzymovým imunosorbentním testem (ELISA).

Statistická analýza bude provedena ve statistickém balíčku SPSS, verze 22.0 (SPSS, Inc. Chicago). Data budou prezentována jako průměr, směrodatná odchylka, medián, maximální a minimální hodnoty, procenta. V závislosti na distribuci dat budou provedeny příslušné parametrické nebo neparametrické testy. K určení prediktorů zjištěných meziskupinových rozdílů budou provedeny regresní modely. Hladina významnosti bude stanovena na 0,05.