Wpływ zaawansowanej fibryny bogatopłytkowej i pochodnej matrycy szkliwa na kliniczne i molekularne parametry gojenia ran po chirurgicznym usunięciu trzecich zębów trzonowych żuchwy

Chirurgiczne usunięcie zatrzymanych zębów mądrości żuchwy często wiąże się z występowaniem bólu pooperacyjnego, obrzękiem, szczękościskiem, a czasami z rozwojem powikłań, takich jak zapalenie kości wyrostka zębodołowego, opóźniona infekcja i powstawanie kieszonki przyzębnej na dystalnej powierzchni drugiego zęba trzonowego. W celu zmniejszenia dyskomfortu i powikłań pooperacyjnych rutynowo przepisuje się niesteroidowe leki przeciwzapalne i antybiotyki.

Omawianą w literaturze opcją terapeutyczną jest umieszczanie w pęcherzykach ekstrakcyjnych materiałów autologicznych i dostępnych na rynku produktów w celu zminimalizowania bólu pooperacyjnego, obrzęku, szczękościsku i powikłań.

Fibryna bogatopłytkowa (PRF) to autologiczna fibryna pochodząca z krwi żylnej pacjenta, bogatej w płytki krwi, leukocyty, czynniki wzrostu i cytokiny. Zaawansowany PRF (APRF) to odmiana PRF, która jest wytwarzana przez mniejszą prędkość wirowania i mniejszą względną siłę odśrodkową przez dłuższy okres czasu w porównaniu do innych typów skrzepów PRF. APRF zawiera leukocyty, czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β), interleukinę -1β (IL1β) i interleukinę-6 (IL6).

Miejscowe zastosowanie APRF w zębodole ekstrakcyjnym po chirurgicznym usunięciu zatrzymanych zębów mądrości żuchwy wykazało pozytywne skutki, takie jak mniejszy ból pooperacyjny, lepsze gojenie tkanek miękkich oraz mniejsza częstość występowania zapalenia kości zębodołowej i opóźnionej infekcji.

Badania in vitro wykazały, że PRF zawiera znaczne ilości VEGF, TGF-β, IL1β, IL6. Badanie in vitro wykazało również, że PRF indukuje polimeryzację makrofagów prozapalnych M1 do makrofagów przeciwzapalnych M2. Makrofagi M2 wytwarzają wyspecjalizowane, pro-rozdzielcze mediatory lipidowe, które są ważne w fazie ustępowania procesu zapalnego i gojenia się ran. Maresin 1 (MaR1), wyspecjalizowany, prorozdzielczy mediator lipidowy, wykazał istotną rolę w indukowaniu szybszego gojenia tkanek miękkich i kości, dlatego obecność tego mediatora może mieć znaczenie we wskazaniu przebiegu gojenia się ran pooperacyjnych. Biorąc pod uwagę dane z badań klinicznych i in vitro, korzystne byłoby określenie na modelu klinicznym, jakim jest chirurgiczne usunięcie zatrzymanych zębów mądrości żuchwy, poziomu VEGF, TGF-β, IL1β, IL6 i MaR1 po umieszczeniu APRF w ekstrakcji zębodołu w porównaniu do standardowego chirurgicznego usunięcia zatrzymanych zębów mądrości żuchwy i porównanie tych poziomów z parametrami klinicznymi przebiegu pooperacyjnego.

Pochodna macierzy szkliwa (EMD) zawiera białka macierzy szkliwa, amelogeniny, ekstrahowane od sześciomiesięcznych prosiąt. Komórki nabłonkowej pochewki korzenia Hertwiga uwalniają na powierzchni korzenia głównie amelogeniny przed utworzeniem cementu, a białka te są czynnikiem inicjującym cementogenezę podczas odontogenezy. Badania in vitro wykazały, że komórki więzadeł przyzębia narażone na działanie EMD wytwarzają TGF-β i IL6. Podobne badanie wykazało, że ekspresja IL1β była znacząco niższa po ekspozycji komórek więzadła przyzębia na EMD. Badania kliniczne i badania in vitro wykazały, że EMD stymuluje angiogenezę poprzez indukcję ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego do wytwarzania VEGF. Wiele badań klinicznych wskazuje na pozytywny wpływ EMD na wady przyzębia.

Jeśli chodzi o badania kliniczne i in vitro, znaczne poziomy VEGF, TGF-β, IL1β, IL6 po umieszczeniu EMD mogłyby w klinicznym modelu chirurgicznego usunięcia zatrzymanych zębów mądrości wskazywać na lepsze gojenie się ran, parametry przyzębia drugiego zęba trzonowego oraz mniejszy dyskomfort i powikłania pooperacyjne . W literaturze nie ma informacji na temat potencjalnego wpływu EMD na produkcję Mar1.

Podstawowym celem badań będzie ocena i porównanie miejscowej odpowiedzi zapalnej i gojenia tkanek miękkich pomiędzy grupami, w których umieszczono APRF lub EMD, a standardowym chirurgicznym usunięciem zatrzymanych zębów mądrości żuchwy poprzez określenie i porównanie poziomów IL6, IL1β, Mar1, VEGF i TGF-β. Podstawowym celem jest również ocena i porównanie poziomu bólu pooperacyjnego, obrzęku, szczękościsku i gojenia tkanek miękkich. Celem drugorzędnym jest ocena częstości występowania zapalenia kości wyrostka zębodołowego, opóźnionej infekcji i rozwoju kieszonki przyzębnej na powierzchni dystalnej drugiego dolnego zęba trzonowego oraz analiza pomiędzy grupami i sprawdzenie, czy istnieje korelacja między parametrami klinicznymi i molekularnymi.

Prospektywne, randomizowane, kontrolowane badanie z podwójnym rozszczepieniem jamy ustnej zostanie przeprowadzone na Wydziale Chirurgii Jamy Ustnej i Laboratorium Nauk Podstawowych Szkoły Medycyny Stomatologicznej Uniwersytetu w Belgradzie w Serbii. Badania zostaną przeprowadzone zgodnie z wytycznymi CONSORT, zgodnie z Deklaracją Helsińską. Po spełnieniu kryteriów włączenia uczestnicy otrzymają ustną i pisemną informację na temat celów badania, protokołu oraz ewentualnych zagrożeń i korzyści płynących z badania. Do badania zostaną włączeni wyłącznie kwalifikujący się uczestnicy, którzy zgodzą się z dostarczonymi informacjami i podpiszą formularz świadomej zgody. Łącznie uwzględnionych zostanie 60 pacjentów (120 operacji) z obustronnie zatrzymanymi zębami mądrości w żuchwie. Wygenerowana komputerowo zablokowana randomizacja ze współczynnikiem alokacji 1:1 (rozmiar bloku 4) zostanie przeprowadzona przez badacza nieuwzględnionego w badaniu (Microsoft Excel, wersja 2016). Aby ukryć przydział, prace zawierające kod przydzielonej grupy (grupa 1-APRF; grupa 2-EMD) zostaną umieszczone w nieprzezroczystych kopertach i zaklejone. Na godzinę przed interwencją ten sam niezależny badacz otworzy następującą kopertę. Po odkryciu grupy eksperymentalnej (APRF lub EMD) niezależny badacz przydzieli bok szczęki grupie kontrolnej lub grupie eksperymentalnej poprzez rzut monetą.

W grupie APRF na 15 minut przed zabiegiem niezależny badacz poinformuje pacjenta o wykonaniu upuszczania krwi i poinstruuje flebotomistę, aby wykonał upuszczanie krwi. Główny badacz nie będzie świadomy przydziału do czasu zakończenia analizy danych. Chirurg będzie świadomy przydziału ze względu na charakter interwencji.

Kryteriami kwalifikacyjnymi do badania są pacjenci zdrowi ogólnoustrojowo, posiadający obustronnie zatrzymane zęby mądrości w żuchwie, stykające się z dystalną powierzchnią drugiego zęba trzonowego żuchwy.

Wiek (lata), płeć i palenie (niepalący, ≤10/dzień lub >10/dzień) zostaną uzyskane od pacjentów, którzy spełnili kryteria włączenia. Podczas tej samej wizyty (pierwszej wizyty w ramach badania) obie interwencje chirurgiczne zostaną zaplanowane w odstępie co najmniej trzech tygodni. Położenie trzecich zębów trzonowych będzie oceniane na zdjęciach panoramicznych, według klasyfikacji Pell i Gregory oraz Wintera. Badanie wstępne, pomiary okołooperacyjne, śródoperacyjne i kontrolne będą wykonywane przez jednego zaślepionego lekarza.

Pobranie płynu dziąsłowego na dystalnej powierzchni drugiego zęba trzonowego żuchwy, pomiary podstawowe maksymalnych zębów międzysiecznych i odległości spoidła tragusowego, zewnętrznego kąta kąta żuchwy po stronie ekstrakcji oraz pomiary przyzębia drugiego zęba trzonowego żuchwy. wykonać na drugiej wizycie w ramach badania, tuż przed operacją. Wykresy przyzębia zostaną wykonane w trzech punktach policzkowych i trzech kolejnych punktach: przyśrodkowo-dytalnie, językowo dystalnie, przyśrodkowo-językowo.

Po regionalnej blokadzie nerwu zębodołowego dolnego, językowego i policzkowego roztworem środka znieczulającego miejscowo, składającego się z 4% chlorowodorku artykainy z adrenaliną 1:100000 (Septanest ®, Septodont, Saint-Maur-des-Fosses, Francja), chirurgiczne usunięcie zatrzymanego trzeci ząb trzonowy żuchwy zostanie wykonany zgodnie z techniką opisaną wcześniej w literaturze: po uniesieniu płata na pełną grubość, usunięcie kości zostanie wykonane instrumentami rotacyjnymi pod płukaniem sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Do ekstrakcji zęba zostaną użyte elewatory i szczypce, a jeśli zajdzie taka potrzeba, zostanie wykonana separacja zębów. Po ekstrakcji zęba i wygładzeniu krawędzi kości, w grupie APRF dwa skrzepy APRF zostaną umieszczone w zębodole, a w grupie EMD dystalna powierzchnia korzenia drugiego zęba trzonowego zostanie poddana zabiegowi 24% EDTA ((PrefGel®, Straumann) przez dwie minut, następnie przepłukać i nałożyć EMD (Emdogain®, Straumann) w połączeniu z gąbką kolagenową (Collacone®, Botiss). Rana zostanie zaszyta polipropylenowym materiałem 4-0, ze szczególnym uwzględnieniem założenia pierwszych dwóch szwów w okolicy zatrzonowcowej w odległości 5 mm, aby umożliwić pobranie wysięku z rany poprzez umieszczenie w ranie papierowych ćwieków podczas wizyt kontrolnych.

W grupach kontrolnych, po ekstrakcji zęba i wygładzeniu brzegów kości, od razu zakładany jest szew pierwotny z tą samą adnotacją, o której mowa powyżej.

Wszystkie zabiegi chirurgiczne będą wykonywane przez jednego doświadczonego chirurga jamy ustnej. Śródoperacyjnie rejestrowany będzie czas trwania zabiegu (w min), ilość użytego roztworu znieczulenia miejscowego (ml), separacja zębów, jeśli została przeprowadzona, oraz wszelkie powikłania śródoperacyjne.

Pacjenci otrzymają tabletki paracetamolu 500 mg ((Paracetamol®, Galenika, Belgrad, Serbia) do zabrania do domu oraz wcześniej zaprojektowane zapytanie do domu, które zawiera pola do rejestracji leku przeciwbólowego (każdy czas przyjęcia, liczba przyjętych tabletek i dawka) . Dodatkowo pacjenci zostaną poinstruowani, aby rejestrowali intensywność bólu w wizualnej skali analogowej (VAS) i werbalnej skali bólu (VRS).

Na trzeciej wizycie kontrolnej (24h po zabiegu) zostanie dokonany pomiar maksymalnych zębów międzysiecznych oraz odległości spoidła tragus-ustnego i zewnętrznego kąta kąta żuchwy od strony ekstrakcji. Pacjenci zostaną również poproszeni o ocenę nasilenia bólu podczas wizyty za pomocą VAS i VRS.

Na czwartej wizycie studyjnej (48h po zabiegu) zostanie dokonany pomiar maksymalnych odległości między siekaczami oraz odległości spoidła tragusowego i zewnętrznego kąta kąta żuchwy od strony ekstrakcji. Podczas tej wizyty zostanie również pobrana próbka wysięku z rany, a pacjenci zostaną ponownie poproszeni o ocenę poziomu bólu za pomocą VAS i VRS.

Na piątej wizycie studyjnej (7 dni po zabiegu) zostanie dokonany pomiar maksymalnych odległości między siekaczami oraz odległości spoidło tragus-ustne i zewnętrzny kąt kątowy żuchwy. Przed zdjęciem szwów zostanie pobrana również próbka wysięku z rany. Podczas tej wizyty pacjenci przyniosą wcześniej zadane pytanie, które wypełniali w ciągu tygodnia.

Szósta wizyta studyjna odbędzie się po trzech miesiącach od zabiegu i zostanie przeprowadzona diagnostyka periodontologiczna.

Próbki będą pobierane za pomocą ćwieków papierowych (rozmiar #30, długość 28 mm, znormalizowane końcówki ISO ze zbieżnością 2%) umieszczanych w ranie na 30 sekund. Zostaną podjęte środki zapobiegające zanieczyszczeniu śliną punktów papierowych podczas pobierania próbek. Papierowe ćwieki zostaną następnie umieszczone w sterylnych plastikowych probówkach wypełnionych płynem zapobiegającym tworzeniu się RNA.

Procedury laboratoryjne zostaną przeprowadzone w celu oceny poziomu względnej ekspresji genów i białek mediatorów stanu zapalnego (IL6, IL1β, MAR1) i wczesnego gojenia ran (VEGF, TGF-β) w badanych grupach w różnych punktach czasowych. Po wyizolowaniu RNA i uzyskaniu komplementarnego DNA (zgodnie z instrukcją producenta) zostanie określona względna ekspresja genów IL6, IL1β, VEGF i TGF-β za pomocą testu reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym. Ekspresja białka MAR1 zostanie przeprowadzona za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona w pakiecie statystycznym SPSS w wersji 22.0 (SPSS, Inc. Chicago). Dane zostaną przedstawione w postaci średniej, odchylenia standardowego, mediany, wartości maksymalnych i minimalnych, procent. W zależności od rozkładu danych zostaną wykonane odpowiednie testy parametryczne lub nieparametryczne. W celu określenia predyktorów wykrytych różnic międzygrupowych zostaną wykonane modele regresji. Poziom istotności zostanie ustalony na poziomie 0,05.