Sérový sST2/miR-223 jako dvojitý biomarker pro aktivitu onemocnění a klinickou účinnost SLIT u alergické rýmy vyvolané roztoči

Rozpustný supresor tumorigenicity 2 (sST2), návnada receptoru pro interleukin-33 (IL-33), zapojený do alergického zánětu. Cíle: Tato studie zkoumala sérový sST2 jako biomarker pro aktivitu onemocnění a pro predikci klinické odpovědi na sublingvální imunoterapii (SLIT) u pacientů s alergickou rýmou (AR) vyvolanou roztoči domácího prachu (HDM).

1. fáze: Studie případů a kontrol provedená po dobu 3 měsíců na Katedře lékařské mikrobiologie a imunologie Lékařské fakulty Zagazigské univerzity ve spolupráci s jednotkou alergologie Nemocnic Zagazigské univerzity od února do května 2025. 2. fáze: Intervenční studie (kvaziexperimentální) pro pacienty s MSAR: provedená po dobu 6 měsíců.

Studijní populace, kritéria zařazení a vyloučení: Oprávnění účastníci byli ve věku 14 let nebo starší s diagnózou AR vyvolané HDM podle pokynů ARIA (Alergická rýma a její vliv na astma). Pacienti museli mít přetrvávající středně těžké až těžké příznaky po dobu alespoň dvou let a být ochotni zahájit a udržovat SLIT po dobu šesti měsíců. Vylučovací kritéria zahrnovala přítomnost autoimunitních nebo chronických zánětlivých stavů, těžké astma nebo jiné plicní onemocnění, systémovou kortikosteroidní nebo imunosupresivní terapii do čtyř týdnů před zařazením, těhotenství nebo kojení a odmítnutí poskytnout informovaný souhlas. Jako kontroly byli náborováni zdraví jedinci přizpůsobení věku a pohlaví bez anamnézy alergického onemocnění a s negativními výsledky prick testů (SPT).

Velikost vzorku:

Velikost vzorku byla vypočtena pomocí Open Epi Info podle následujícího: průměrná hladina sST2 u případů AR versus kontrola byla 19,8 ± 7,5 versus 14,3 ± 6,9 (ref.) při síle studie 80 %, CI 95 %, poměr případů:kontrolám 1:1. Minimální požadovaná velikost vzorku byla 27 účastníků ve skupině. Nicméně podařilo se nám náborovat 54 účastníků v každé skupině, všichni byli zahrnuti do konečné analýzy. Účastníci byli vybráni pomocí techniky jednoduchého náhodného výběru podle předem stanovených kritérií zařazení.

• Klinické a laboratorní postupy
• Základní hodnocení: Všichni účastníci podstoupili podrobné klinické hodnocení včetně demografických údajů, délky trvání onemocnění, indexu tělesné hmotnosti (BMI) a předchozí anamnézy léčby.
• Hodnocení příznaků: Závažnost příznaků byla hodnocena pomocí TNSS, která zahrnuje čtyři parametry – rýmu, nosní kongesci, svědění v nose a kýchání – každý hodnocený na stupnici 0 až 4, pro maximální skóre 16. Kvantifikaci celkové zátěže příznaky byla také použita 10cm vizuální analogová škála (VAS).
• Kožní prick testy (SPT): SPT byly provedeny pomocí standardizovaných alergenových extraktů včetně Dermatophagoides pteronyssinus a D. farinae. Histamin a fyziologický roztok sloužily jako pozitivní a negativní kontrola. Puchýřek o průměru ≥3 mm ve srovnání s negativní kontrolou byl považován za pozitivní.
• Imunologický marker a měření sST2: Žilní vzorky krve byly odebrány od všech účastníků na začátku studie ke stanovení sérových eozinofilů, celkových hladin imunoglobulinu E (IgE) a HDM-specifického IgE (kU/l) měřeného pomocí enzymového imunosorbentního testu (ELISA) podle protokolu výrobce (Chemus Bioscience, USA).

Koncentrace sST2 byly kvantifikovány pomocí komerční ELISA soupravy (Elabscience, kat. č. E-EL-H6082). U pacientů podstupujících SLIT byly odebrány další sérové vzorky po šesti měsících léčby. Všechna měření byla provedena v duplikátech. Laboratorní personál provádějící testy nebyl informován o klinických údajích a čase odběru vzorků.

- Detekce expresní hladiny mikroRNA-223 pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qRT-PCR): MikroRNA byla extrahována pomocí komerčních souprav miRNeasy Serum/Plasma Kits (Qiagen, Německo) podle pokynů výrobce. Po extrakci byla mikroRNA reverzně transkribována pomocí souprav pro reverzní transkripci (miScript II RT Kit, Qiagen, Německo) podle pokynů výrobce. Poté byla inkubována v suchém lázňovém bloku (Rocker Sahara 320 dry bath heat block, Rocker Scientific, Tchaj-wan), zpočátku při 37 °C po dobu 60 minut, následovaná druhou inkubací při 95 °C po dobu 5 minut pro inaktivaci miScript RT. Poté byla reakční směs skladována při -80 °C. Kvantitativní stanovení zralé miR-223 bylo provedeno pomocí cílených miScript Primer Assays s použitím komerčních souprav (miScript SYBR Green real-time PCR Kit, Qiagen, Německo) podle pokynů výrobce. Lidský RNU6B (RNU6-2) byl použit jako referenční gen. Po počáteční aktivační fázi HotStar Taq DNA Polymerase po dobu 15 minut při 95 °C byly reakce real-time PCR spuštěny na 40 cyklů, každý s denaturací po dobu 15 s při 95 °C, hybridizací po dobu 30 s při 55 °C a prodloužením po dobu 30 s při 70 °C. Software platformy Stratagene Mx3005P (Agilent Technologies, USA) byl použit ke stanovení hodnoty prahového cyklu (Ct). Pro odhad změn exprese miR-223 byl použit vzorec delta-delta Ct.

- Intervenční fáze pro pacienty s MSAR: Protokol sublingvální imunoterapie (SLIT): Pacienti dostávali standardizovanou denní SLIT obsahující HDM extrakty po dobu šesti měsíců. Podávání začalo pod klinickým dohledem a pacienti byli měsíčně monitorováni pro adherenci a nežádoucí účinky. Terapeutická odpověď byla hodnocena po šesti měsících na základě složeného výsledku: snížení kombinovaného skóre příznaků a medikace o alespoň 30 %, zlepšení skóre TNSS a VAS a pokles hladin sérového sST2. Pacienti splňující tato kritéria byli klasifikováni jako respondéři; ti, kteří nedosáhli prahu, byli považováni za nerepondéry.