Serum sST2/miR-223 als dualer Biomarker für Krankheitsaktivität & klinische Wirksamkeit der SLIT bei HDM-induzierter allergischer Rhinitis

Löslicher Suppressor der Tumorigenität 2 (sST2), ein Decoy-Rezeptor von Interleukin-33 (IL-33), der an allergischen Entzündungen beteiligt ist. Ziele: Diese Studie untersuchte Serum-sST2 als Biomarker für die Krankheitsaktivität und zur Vorhersage des klinischen Ansprechens auf sublinguale Immuntherapie (SLIT) bei Patienten mit Hausstaubmilben (HDM) induzierter AR.

1. Stufe: Eine Fall-Kontroll-Studie, die über 3 Monate an der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Zagazig in Zusammenarbeit mit der Allergieeinheit der Zagazig-Universitätskliniken von Februar bis Mai 2025 durchgeführt wurde. 2. Stufe: Eine Interventionsstudie (quasi-experimentell) für (MSAR-Patienten): durchgeführt über 6 Monate.

Studienpopulation, Einschluss- und Ausschlusskriterien: Berechtigte Teilnehmer waren 14 Jahre oder älter mit einer Diagnose von HDM-induzierter AR gemäß den ARIA-Leitlinien (Allergische Rhinitis und ihr Einfluss auf Asthma). Die Patienten mussten seit mindestens zwei Jahren anhaltende moderate bis schwere Symptome aufweisen und bereit sein, eine SLIT für sechs Monate zu beginnen und fortzuführen. Ausschlusskriterien umfassten das Vorliegen von Autoimmun- oder chronisch entzündlichen Erkrankungen, schwerem Asthma oder anderen Lungenerkrankungen, systemischer Kortikosteroid- oder immunsuppressiver Therapie innerhalb von vier Wochen vor der Einschreibung, Schwangerschaft oder Stillzeit sowie die Weigerung, eine Einwilligungserklärung zu unterzeichnen. Gesunde, alters- und geschlechtsangepasste Personen ohne Vorgeschichte allergischer Erkrankungen und mit negativen Hautpricktest-Ergebnissen (SPT) wurden als Kontrollen rekrutiert.

Stichprobengröße:

Die Stichprobengröße wurde unter Verwendung von Open Epi Info basierend auf folgenden mittleren sST2-Spiegeln berechnet: AR-Fälle versus Kontrolle: 19,8 ± 7,5 versus 14,3 ± 6,9 (Ref.) bei einer Teststärke von 80%, 95% Konfidenzintervall, Fall:Kontrolle 1:1. Die minimal erforderliche Stichprobengröße betrug 27 Teilnehmer pro Gruppe. Es konnten jedoch 54 Teilnehmer pro Gruppe rekrutiert werden, die alle in die endgültige Analyse einbezogen wurden. Die Teilnehmer wurden nach den vordefinierten Einschlusskriterien mittels einer einfachen Zufallsstichprobe ausgewählt.

• Klinische und Laborverfahren
• Basisbewertung: Alle Teilnehmer unterzogen sich einer detaillierten klinischen Bewertung, einschließlich demografischer Daten, Krankheitsdauer, Body-Mass-Index (BMI) und vorheriger Behandlungsgeschichte.
• Symptombewertung: Die Schwere der Symptome wurde mittels des TNSS (Total Nasal Symptom Score) bewertet, der vier Parameter umfasst – Rhinorrhö, nasale Kongestion, nasalen Juckreiz und Niesen – jeweils auf einer Skala von 0 bis 4, für einen maximalen Score von 16. Eine 10-cm Visuelle Analogskala (VAS) wurde ebenfalls verwendet, um die gesamte Symptomlast zu quantifizieren.
• Hautpricktest (SPT): Der SPT wurde mit standardisierten Allergenextrakten durchgeführt, einschließlich Dermatophagoides pteronyssinus und D. farinae. Histamin und Kochsalzlösung dienten als positive bzw. negative Kontrollen. Eine Quaddeldurchmesser von ≥3 mm im Vergleich zur negativen Kontrolle wurde als positiv gewertet.
• Immunologischer Marker und sST2-Messung: Von allen Teilnehmern wurden zu Studienbeginn venöse Blutproben entnommen, um Serum-Eosinophile, Gesamt-Immunglobulin-E (IgE)-Spiegel und hausstaubmilbenspezifisches HDM-IgE (kU/l) mittels Enzymimmunoassay (ELISA) gemäß Herstellerprotokoll (Chemus Bioscience, USA) zu bestimmen.

sST2-Konzentrationen wurden mit einem kommerziellen ELISA-Kit quantifiziert (Elabscience, Kat. Nr. E-EL-H6082). Für Patienten, die eine SLIT erhielten, wurden nach sechsmonatiger Therapie zusätzliche Serumproben entnommen. Alle Messungen wurden in Doppelbestimmung durchgeführt. Das Laborpersonal, das die Assays durchführte, war gegenüber den klinischen Informationen und dem Probenentnahmezeitpunkt verblindet.

- Nachweis der microRNA-223-Expressionshöhe mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR): MicroRNA wurde mit kommerziellen miRNeasy Serum/Plasma-Kits (Qiagen, Deutschland) gemäß Herstelleranleitung extrahiert. Nach der Extraktion wurde die microRNA mit Reverse-Transkriptions-Kits (miScript II RT Kit, Qiagen, Deutschland) gemäß Herstelleranleitung revers transkribiert. Anschließend wurde sie in einem Trockenbadblock (Rocker Sahara 320 Trockenbad-Heizblock, Rocker Scientific, Taiwan) inkubiert, zunächst bei 37°C für 60 min, gefolgt von einer zweiten Inkubation bei 95°C für 5 min, um die miScript RT zu inaktivieren. Danach wurde die Reaktionsmischung bei -80°C gelagert. Die quantitative Bestimmung von reifer miR-223 erfolgte mit zielspezifischen miScript Primer Assays unter Verwendung kommerzieller Kits (miScript SYBR Green Echtzeit-PCR-Kit, Qiagen, Deutschland) gemäß Herstelleranleitung. Humanes RNU6B (RNU6-2) wurde als Referenzgen verwendet. Nach dem anfänglichen Aktivierungsschritt der HotStar Taq DNA-Polymerase für 15 min bei 95°C liefen die Echtzeit-PCR-Reaktionen für 40 Zyklen, jeweils bestehend aus Denaturierung für 15 s bei 95°C, Annealing für 30 s bei 55°C und Extension für 30 s bei 70°C. Die Stratagene Mx3005P-Plattformsoftware (Agilent Technologies, USA) wurde verwendet, um den Schwellenwert-Zyklus (Ct-Wert) zu ermitteln. Die Delta-Delta-Ct-Methode wurde verwendet, um die Veränderungen der miR-223-Expression in Vielfachen zu schätzen.

- Interventionsphase für (MSAR-Patienten) Sublinguale Immuntherapie (SLIT)-Protokoll: Die Patienten erhielten über einen Zeitraum von sechs Monaten standardisierte tägliche SLIT mit HDM-Extrakten. Die Verabreichung begann unter klinischer Aufsicht, und die Patienten wurden monatlich auf Adhärenz und Nebenwirkungen überwacht. Das therapeutische Ansprechen wurde nach sechs Monaten basierend auf einem zusammengesetzten Ergebnis bewertet: einer Reduktion von mindestens 30% im kombinierten Symptom- und Medikationsscore, Verbesserung der TNSS- und VAS-Scores sowie einer Abnahme der Serum-sST2-Spiegel. Patienten, die diese Kriterien erfüllten, wurden als Responder eingestuft; diejenigen, die die Schwelle nicht erreichten, galten als Non-Responder.