Сывороточный sST2/ miR-223 как двойной биомаркер для активности заболевания и клинической эффективности СЛИТ при аллергическом рините, индуцированном HDM

Растворимый супрессор опухолеобразования 2 (sST2), рецептор-ловушка интерлейкина-33 (IL-33), участвующий в аллергическом воспалении. Цели: В этом исследовании изучалась сывороточная sST2 в качестве биомаркера активности заболевания и для прогнозирования клинического ответа на сублингвальную иммунотерапию (СЛИТ) у пациентов с аллергическим ринитом (АР), индуцированным клещом домашней пыли (КДП).

1-й этап: Исследование случай-контроль, проведенное в течение 3 месяцев на кафедре медицинской микробиологии и иммунологии медицинского факультета Университета Загазиг в сотрудничестве с аллергологическим отделением университетских больниц Загазиг с февраля по май 2025 года. 2-й этап: Интервенционное исследование (квазиэкспериментальное) для пациентов с АР: проведенное в течение 6 месяцев.

Популяция исследования, критерии включения и исключения. Подходящие участники были в возрасте 14 лет и старше с диагнозом АР, индуцированного КДП, согласно руководствам ARIA (Аллергический ринит и его влияние на астму). От пациентов требовалось наличие персистирующих симптомов средней и тяжелой степени тяжести в течение не менее двух лет и готовность начать и продолжать СЛИТ в течение шести месяцев. Критерии исключения включали наличие аутоиммунных или хронических воспалительных заболеваний, тяжелой астмы или других заболеваний легких, системной терапии кортикостероидами или иммуносупрессорами в течение четырех недель до включения в исследование, беременность или лактацию, а также отказ от предоставления информированного согласия. Здоровые лица, сопоставимые по возрасту и полу, без истории аллергических заболеваний и с отрицательными результатами кожных прик-тестов (КПТ), были набраны в качестве контрольной группы.

Размер выборки:

Размер выборки был рассчитан с использованием Open Epi Info на основе следующих средних уровней sST2 среди случаев АР по сравнению с контролем: 19,8 ± 7,5 против 14,3 ± 6,9 (ссылка) при мощности исследования 80%, доверительном интервале 95%, соотношении случай:контроль 1:1. Минимально необходимый размер выборки составил 27 участников на группу. Однако нам удалось набрать 54 участника в каждой группе, и все они были включены в окончательный анализ. Участники были отобраны с использованием метода простой случайной выборки в соответствии с предопределенными критериями включения.

• Клинические и лабораторные процедуры
• Исходная оценка. Все участники прошли подробное клиническое обследование, включая демографические данные, продолжительность заболевания, индекс массы тела (ИМТ) и историю предыдущего лечения.
• Оценка симптомов. Тяжесть симптомов оценивалась с использованием TNSS (общий назальный симптом-скор), который включает четыре параметра: ринорея, заложенность носа, зуд в носу и чихание, каждый из которых оценивается по шкале от 0 до 4, что дает максимальный балл 16. Также использовалась 10-сантиметровая Визуальная Аналоговая Шкала (ВАШ) для количественной оценки общей симптоматической нагрузки.
• Кожный прик-тест (КПТ). КПТ проводился с использованием стандартизированных экстрактов аллергенов, включая Dermatophagoides pteronyssinus и D. farinae. Гистамин и физиологический раствор служили положительным и отрицательным контролем соответственно. Волдырь диаметром ≥3 мм по сравнению с отрицательным контролем считался положительным.
• Измерение иммунологических маркеров и sST2. У всех участников на исходном уровне были взяты образцы венозной крови для определения сывороточных эозинофилов, уровня общего иммуноглобулина Е (IgE) и специфического к клещу домашней пыли HDM-IgE (kU/л), измеренного с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с протоколом производителя (Chemus Bioscience, США).

Концентрации sST2 количественно определяли с использованием коммерческого набора для ИФА (Elabscience, Cat No. E-EL-H6082). Для пациентов, проходящих СЛИТ, дополнительные образцы сыворотки были собраны после шести месяцев терапии. Все измерения проводились в двух экземплярах. Лабораторный персонал, проводивший анализы, не знал клинической информации и времени взятия проб.

- Определение уровня экспрессии микро-РНК-223 с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР-РВ): Микро-РНК экстрагировали с использованием коммерческих наборов miRNeasy Serum/Plasma Kits (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. После экстракции микро-РНК подвергали обратной транскрипции с использованием наборов для обратной транскрипции (miScript II RT Kit, Qiagen, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Затем ее инкубировали в сухом термоблоке (Rocker Sahara 320 dry bath heat block, Rocker Scientific, Тайвань): сначала при 37°C в течение 60 минут, затем вторую инкубацию при 95°C в течение 5 минут для инактивации miScript RT. После этого реакционную смесь хранили при -80°C. Количественное определение зрелой miR-223 выполняли с использованием специфичных праймеров miScript Primer Assays и коммерческих наборов (miScript SYBR Green real-time PCR Kit, Qiagen, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. В качестве референсного гена использовали человеческий ген RNU6B (RNU6-2). После начального этапа активации HotStar Taq ДНК-полимеразы в течение 15 минут при 95°C, реакции кПЦР-РВ проводили в течение 40 циклов, каждый из которых включал денатурацию в течение 15 с при 95°C, отжиг в течение 30 с при 55°C и элонгацию в течение 30 с при 70°C. Программное обеспечение платформы Stratagene Mx3005P (Agilent Technologies, США) использовалось для определения значения порогового цикла (Ct). Для оценки кратности изменения экспрессии miR-223 использовали формулу метода дельта-дельта Ct.

- Интервенционный этап для пациентов с АР. Протокол сублингвальной иммунотерапии (СЛИТ). Пациенты получали стандартизированную ежедневную СЛИТ, содержащую экстракты КДП, в течение шести месяцев. Прием начинался под клиническим наблюдением, и пациенты ежемесячно контролировались на предмет соблюдения режима и побочных эффектов. Терапевтический ответ оценивался через шесть месяцев на основе комплексного исхода: снижение комбинированного балла симптомов и лекарств не менее чем на 30%, улучшение показателей TNSS и ВАШ, а также снижение уровня сывороточной sST2. Пациенты, соответствующие этим критериям, классифицировались как отвечающие на лечение; те, кто не достиг порога, считались не отвечающими.