Seerumin sST2/miR-223 kaksoisbiomarkkerina sairauden aktiivisuudelle ja SLIT:n kliinisen tehokkuuden arvioinnille HDM-allergisessa nuhanuhaissessa

Soluperäinen tumorigeneesin 2:n (sST2) supressori, interleukiini-33:n (IL-33) syöttöreseptori, joka osallistuu allergiseen tulehdukseen. Tavoitteet: Tässä tutkimuksessa selvitettiin seerumin sST2:n soveltuvuutta tautiaktiviteetin biomarkkerina ja kliinisen vastauksen ennustajana alakieleen annettavalle immunoterapialle (SLIT) kodinkoipölypunkin (HDM) aiheuttaman allergisen riniitin (AR) potilailla.

1. vaihe: Tapauskontrollitutkimus, joka suoritettiin 3 kuukauden ajan Zagazigin yliopiston lääketieteellisen mikrobiologian ja immunologian laitoksella lääketieteellisen tiedekunnan yhteistyössä Zagazigin yliopistosairaaloiden allergiayksikön kanssa helmikuusta toukokuuhun 2025. 2. vaihe: interventiotutkimus (kvasikokeellinen) (MSAR-potilaille): suoritettu 6 kuukauden ajan.

Tutkimuspopulaatio, sisällyttämis- ja poissulkemiskriteerit: Kelvolliset osallistujat olivat 14-vuotiaita tai vanhempia, joilla oli diagnosoitu HDM-aiheutunut AR ja sen vaikutus astmaan (ARIA) -ohjeistojen mukaisesti. Potilailta vaadittiin, että heillä oli jatkuvia kohtalaisia tai vakavia oireita vähintään kaksi vuotta ja että he olivat halukkaita aloittamaan ja ylläpitämään SLIT-hoitoa kuusi kuukautta. Poissulkemiskriteereihin kuuluivat autoimmuuni- tai krooniset tulehdustilat, vakava astma tai muu keuhkosairaus, systeeminen kortikosteroidi- tai immunosupressiivinen hoito neljän viikon kuluessa ennen osallistumista, raskaus tai imetys sekä kieltäytyminen antamasta tietoon perustuvaa suostumusta. Terveitä, ikä- ja sukupuolivastaavia henkilöitä, joilla ei ollut allergista sairautta ja joilla oli negatiiviset pistotestitulokset (SPT), rekrytoitiin kontrolliryhmään.

Otoskoko:

Otoskoko laskettiin käyttäen open epi info -ohjelmaa seuraavan seerumin sST2-tason perusteella AR-tapauksissa verrattuna kontrolliryhmään: 19,8±7,5 vs. 14,3±6,9 (viite) tutkimuksen teho 80 %, luottamusväli 95 %, tapaus:kontrolli 1:1, vähimmäisvaadittu otoskoko oli 27 osallistujaa per ryhmä. Kuitenkin onnistuimme rekrytoimaan 54 osallistujaa kummassakin ryhmässä, ja kaikki heidät sisällytettiin lopulliseen analyysiin. Osallistujat valittiin käyttäen yksinkertaista satunnaisotantatekniikkaa ennalta määriteltyjen sisällyttämiskriteerien mukaisesti.

• Kliiniset ja laboratoriomenettelyt
• Perustason arviointi: Kaikki osallistujat kävivät läpi yksityiskohtaisen kliinisen arvioinnin, mukaan lukien demografiset tiedot, sairauden kesto, painoindeksi (BMI) ja aiempi hoitohistoria.
• Oirepisteytys: Oireiden vakavuutta arvioitiin käyttäen TNSS-asteikkoa, joka sisältää neljä parametria – vuotavuus, nenän tukkoisuus, nenän kutina ja aivastus – joista jokainen arvioidaan asteikolla 0–4, enimmäispistemäärä 16. Myös 10 cm:n visuaalista analogiasuuntaa (VAS) käytettiin kokonaisoirekuorman mittaamiseen.
• Pistotestaus (SPT): SPT suoritettiin käyttäen standardoituja allergeeniuutteita, mukaan lukien Dermatophagoides pteronyssinus ja D. farinae. Histamiini ja suolaliuos toimivat positiivisina ja negatiivisina kontrollina. Rakkulan halkaisija ≥3 mm verrattuna negatiiviseen kontrolliin katsottiin positiiviseksi.
• Immunologinen merkki ja sST2-mittaus: Laskimoverinäytteet kerättiin kaikilta osallistujilta perustasolla seerumin eosinofiilien, kokonaisimmunoglobuliini E (IgE) -tason ja kodinkoipölypunkkispesifisen HDM-IgE:n (kU/l) määrittämiseksi käyttäen entsyymiliitostestin (ELISA) valmistajan protokollan mukaisesti (Chemus Bioscience, USA).

sST2-pitoisuuksia kvantifioitiin käyttäen kaupallista ELISA-sarjaa (Elabscience, tuotenro E-EL-H6082). SLIT-hoitoa saavilta potilailta kerättiin lisäseeruminäytteitä kuuden kuukauden hoidon jälkeen. Kaikki mittaukset suoritettiin kahdessa kopiossa. Laboratoriohenkilöstö, joka suoritti testit, ei tiennyt kliinisistä tiedoista eikä näytteenoton ajankohdasta.

- MikroRNA-223-ilmentymistason havaitseminen kvantitatiivisen polymeraasiketjureaktion (qRT-PCR) avulla: MikroRNA eristettiin käyttäen kaupallisia miRNeasy Serum/Plasma -sarjoja (Qiagen, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eristämisen jälkeen mikroRNA käännetään käänteiskopiointisarjoilla (miScript II RT Kit, Qiagen, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten se inkuboitiin kuivakylpyblokissa (Rocker Sahara 320 dry bath heat block, Rocker Scientific, Taiwan), aluksi 37°C:ssa 60 minuuttia, minkä jälkeen toinen inkubaatio 95°C:ssa 5 minuuttia miScript RT:n inaktivoimiseksi. Tämän jälkeen reaktioeseos säilytettiin -80°C:ssa. Kypsän miR-223:n kvantitatiivinen määritys suoritettiin kohdespesifisillä miScript Primer Assays -sarjoilla käyttäen kaupallisia sarjoja (miScript SYBR Green real-time PCR Kit, Qiagen, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ihmisen RNU6B:tä (RNU6-2) käytettiin kotitalouksien säätelygeeninä. HotStar Taq DNA-polymeraasin alkuperäisen aktivointivaiheen jälkeen 15 minuuttia 95°C:ssa, reaaliaikaiset PCR-reaktiot suoritettiin 40 sykliä, joista jokainen denaturointi 15 s 95°C:ssa, annealing 30 s 55°C:ssa ja laajennus 30 s 70°C:ssa. Stratagene Mx3005P-alustan ohjelmistoa (Agilent Technologies, USA) käytettiin kynnyssykli (Ct) -arvon selvittämiseen. Delta-delta Ct -menetelmän kaavaa käytettiin miR-223-ilmentymän kertaluokkien muutosten arvioimiseen.

- Interventiovaihe (MSAR-potilaille) Alakieleen annettavan immunoterapian (SLIT) protokolla: Potilaat saivat standardoitua päivittäistä SLIT-hoitoa, joka sisälsi HDM-uutteita kuuden kuukauden ajan. Annostelua aloitettiin kliinisen valvonnan alaisena, ja potilaita seurattiin kuukausittain noudattamisen ja haittavaikutusten osalta. Terapeuttinen vastaus arvioitiin kuuden kuukauden kuluttua yhdistetyn tuloksen perusteella: vähintään 30 %:n väheneminen yhdistetyssä oire- ja lääkepistemäärässä, parannus TNSS- ja VAS-pisteissä sekä seerumin sST2-tason lasku. Näitä kriteerejä täyttävät potilaat luokiteltiin vastaajiksi; ne, jotka eivät täyttäneet kynnystä, katsottiin ei-vastaajiksi.