sST2 sérico / miR-223 como Biomarcador Duplo para Atividade da Doença e Eficácia Clínica da SLIT na Rinite Alérgica Induzida por Ácaros

A supressão solúvel da tumorigenicidade 2 (sST2), um recetor isca da interleucina-33 (IL-33), envolvida na inflamação alérgica. Objetivos: Este estudo explorou o sST2 sérico como biomarcador para a atividade da doença e para prever a resposta clínica à imunoterapia sublingual (SLIT) em doentes com rinite alérgica (RA) induzida por ácaros do pó doméstico (HDM).

1ª fase: Um estudo de caso-controlo realizado ao longo de 3 meses no Departamento de Microbiologia Médica e Imunologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Zagazig, em colaboração com a Unidade de Alergologia dos Hospitais Universitários de Zagazig, de fevereiro a maio de 2025. 2ª fase: Um estudo intervencional (quase experimental) para (doentes com MSAR): realizado ao longo de 6 meses.

População do Estudo, Critérios de Inclusão e Exclusão Os participantes elegíveis tinham 14 anos ou mais, com diagnóstico de RA induzida por HDM e de acordo com as diretrizes de Impacto da Rinite Alérgica na Asma (ARIA). Os doentes eram obrigados a ter sintomas persistentes, moderados a graves, há pelo menos dois anos e a estar dispostos a iniciar e manter a SLIT durante seis meses. Os critérios de exclusão incluíam a presença de doenças autoimunes ou condições inflamatórias crónicas, asma grave ou outra doença pulmonar, terapia com corticosteroides sistémicos ou imunossupressores nas quatro semanas anteriores à inscrição, gravidez ou lactação, e recusa em dar consentimento informado. Indivíduos saudáveis, emparelhados por idade e sexo, sem historial de doença alérgica e com resultados negativos no teste cutâneo de picada (SPT) foram recrutados como controlos.

Tamanho da amostra:

O tamanho da amostra foi calculado utilizando o Open Epi Info de acordo com o seguinte nível médio de sST2 entre os casos de RA versus controlo: 19,8±7,5 versus 14,3±6,9 (ref.) com um poder do estudo de 80%, IC 95%, caso:controlo 1:1. O tamanho mínimo da amostra necessário foi de 27 participantes por grupo. No entanto, conseguimos recrutar 54 participantes em cada grupo, todos incluídos na análise final. Os participantes foram selecionados utilizando uma técnica de amostragem aleatória simples de acordo com os critérios de inclusão predefinidos.

• Procedimentos Clínicos e Laboratoriais
• Avaliação Inicial Todos os participantes foram submetidos a uma avaliação clínica detalhada, incluindo dados demográficos, duração da doença, índice de massa corporal (IMC) e historial de tratamentos anteriores.
• Pontuação de Sintomas A gravidade dos sintomas foi avaliada utilizando o TNSS, que inclui quatro parâmetros: rinorreia, congestão nasal, prurido nasal e espirros, cada um classificado numa escala de 0 a 4, para uma pontuação máxima de 16. Uma Escala Visual Analógica (VAS) de 10 cm também foi utilizada para quantificar a carga global de sintomas.
• Teste Cutâneo de Picada (SPT) O SPT foi realizado utilizando extratos alergénicos padronizados, incluindo Dermatophagoides pteronyssinus e D. farinae. A histamina e a solução salina serviram como controlos positivo e negativo, respetivamente. Um diâmetro de pápula ≥3 mm em comparação com o controlo negativo foi considerado positivo.
• Marcador imunológico e medição de sST2 Amostras de sangue venoso foram colhidas de todos os participantes no início para determinar eosinófilos séricos, níveis totais de imunoglobulina E (IgE) e IgE específica para ácaros do pó doméstico (HDM-IgE, kU/l) medidos por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) de acordo com o protocolo do fabricante (Chemus Bioscience, EUA).

As concentrações de sST2 foram quantificadas utilizando um kit ELISA comercial (Elabscience, Cat. No. E-EL-H6082). Para os doentes submetidos a SLIT, foram colhidas amostras de soro adicionais após seis meses de terapia. Todas as medições foram realizadas em duplicado. O pessoal laboratorial que realizou os ensaios estava cego para a informação clínica e o momento da colheita.

- Deteção do nível de expressão do microRNA-223 por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR): O microRNA foi extraído por kits comerciais miRNeasy Serum/Plasma Kits (Qiagen, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Após extração, o microRNA foi transcrito reversamente por kits de transcrição reversa (miScript II RT Kit, Qiagen, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, foi incubado em bloco de banho seco (Rocker Sahara 320 dry bath heat block, Rocker Scientific, Taiwan), inicialmente a 37°C durante 60 min, seguido de uma segunda incubação a 95°C durante 5 min para inativar o miScript RT. Depois disso, a mistura da reação foi armazenada a -80°C. A determinação quantitativa do miR-223 maduro foi realizada por ensaios de iniciadores miScript específicos para o alvo utilizando kits comerciais (miScript SYBR Green real-time PCR Kit, Qiagen, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. O RNU6B humano (RNU6-2) foi utilizado como gene de referência. Após o passo de ativação inicial da HotStar Taq DNA Polymerase durante 15 min a 95°C, as reações de PCR em tempo real foram executadas por 40 ciclos, cada um consistindo em desnaturação durante 15 s a 95°C, hibridação durante 30 s a 55°C e extensão durante 30 s a 70°C. O software da plataforma Stratagene Mx3005P (Agilent Technologies, EUA) foi utilizado para determinar o valor do ciclo limiar (Ct). A fórmula do método delta-delta Ct foi utilizada para estimar as alterações na expressão do miR-223.

- Fase de intervenção para (doentes com MSAR) Protocolo de Imunoterapia Sublingual (SLIT) Os doentes receberam SLIT diária padronizada contendo extratos de HDM durante um período de seis meses. A administração começou sob supervisão clínica, e os doentes foram monitorizados mensalmente quanto à adesão e efeitos adversos. A resposta terapêutica foi avaliada após seis meses com base num resultado composto: uma redução de pelo menos 30% na pontuação combinada de sintomas e medicação, melhoria nas pontuações TNSS e VAS e uma diminuição nos níveis séricos de sST2. Os doentes que cumpriam estes critérios foram classificados como respondedores; aqueles que não atingiam o limiar foram considerados não respondedores.