Siero sST2/miR-223 come Biomarcatore Duplice per l'Attività della Malattia e l'Efficacia Clinica della SLIT nella Rinite Allergica Indotta da Acari della Polvere

Il recettore esca della soppressione della tumorigenicità 2 solubile (sST2), un recettore esca dell'interleuchina-33 (IL-33), coinvolto nell'infiammazione allergica. Obiettivi: Questo studio ha esplorato il siero sST2 come biomarcatore per l'attività della malattia e per prevedere la risposta clinica all'immunoterapia sublinguale (SLIT) nei pazienti con rinite allergica (AR) indotta dagli acari della polvere domestica (HDM).

Fase 1: Uno studio caso-controllo condotto per 3 mesi presso il Dipartimento di Microbiologia Medica e Immunologia, Facoltà di Medicina, Università di Zagazig, in collaborazione con l'Unità di Allergologia degli Ospedali Universitari di Zagazig da febbraio a maggio 2025. Fase 2: Uno studio interventistico (quasi sperimentale) per pazienti con AR indotta da HDM: condotto per 6 mesi.

Popolazione dello studio, criteri di inclusione ed esclusione I partecipanti idonei avevano 14 anni o più con una diagnosi di AR indotta da HDM secondo le linee guida ARIA (Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma). I pazienti dovevano avere sintomi persistenti da moderati a gravi per almeno due anni ed essere disposti a iniziare e mantenere la SLIT per sei mesi. I criteri di esclusione includevano la presenza di condizioni autoimmuni o infiammatorie croniche, asma grave o altre malattie polmonari, terapia con corticosteroidi sistemici o immunosoppressori entro quattro settimane prima dell'arruolamento, gravidanza o allattamento, e rifiuto di fornire il consenso informato. Individui sani, abbinati per età e sesso, senza storia di malattie allergiche e con risultati negativi al prick test cutaneo (SPT), sono stati reclutati come controlli.

Dimensione del campione:

La dimensione del campione è stata calcolata utilizzando Open Epi Info in base ai seguenti livelli medi di sST2 nei casi di AR rispetto ai controlli: 19,8±7,5 rispetto a 14,3±6,9 (rif.) con una potenza dello studio dell'80%, intervallo di confidenza del 95%, rapporto casi:controlli 1:1. La dimensione minima richiesta del campione era di 27 partecipanti per gruppo. Tuttavia, siamo riusciti a reclutare 54 partecipanti in ciascun gruppo, tutti inclusi nell'analisi finale. I partecipanti sono stati selezionati utilizzando una tecnica di campionamento casuale semplice secondo i criteri di inclusione predefiniti.

• Procedure cliniche e di laboratorio
• Valutazione basale Tutti i partecipanti hanno subito una valutazione clinica dettagliata, inclusi dati demografici, durata della malattia, indice di massa corporea (BMI) e storia dei trattamenti precedenti.
• Punteggio dei sintomi La gravità dei sintomi è stata valutata utilizzando il TNSS, che include quattro parametri - rinorrea, congestione nasale, prurito nasale e starnuti - ciascuno valutato su una scala da 0 a 4, per un punteggio massimo di 16. È stata utilizzata anche una scala analogica visiva (VAS) di 10 cm per quantificare il carico complessivo dei sintomi.
• Prick Test Cutaneo (SPT) L'SPT è stato eseguito utilizzando estratti allergenici standardizzati, inclusi Dermatophagoides pteronyssinus e D. farinae. L'istamina e la soluzione salina sono servite rispettivamente come controlli positivo e negativo. Un diametro del pomfo ≥3 mm rispetto al controllo negativo è stato considerato positivo.
• Marcatore immunologico e misurazione di sST2 Campioni di sangue venoso sono stati prelevati da tutti i partecipanti al basale per determinare gli eosinofili sierici, i livelli totali di immunoglobulina E (IgE) e l'IgE specifica per gli acari della polvere domestica (HDM-IgE, kU/l) misurati mediante saggio immunoassorbente legato all'enzima (ELISA) secondo il protocollo del produttore (Chemus Bioscience, USA).

Le concentrazioni di sST2 sono state quantificate utilizzando un kit ELISA commerciale (Elabscience, Cat No. E-EL-H6082). Per i pazienti sottoposti a SLIT, sono stati raccolti ulteriori campioni di siero dopo sei mesi di terapia. Tutte le misurazioni sono state eseguite in duplicato. Il personale di laboratorio che ha condotto i saggi era in cieco rispetto alle informazioni cliniche e al tempo di campionamento.

- Rilevamento del livello di espressione del microRNA-223 mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (qRT-PCR): Il microRNA è stato estratto utilizzando kit commerciali miRNeasy Siero/Plasma (Qiagen, Germania), secondo le istruzioni del produttore. Dopo l'estrazione, il microRNA è stato trascritto inversamente utilizzando kit di trascrizione inversa (miScript II RT Kit, Qiagen, Germania) secondo le istruzioni del produttore. Quindi, è stato incubato in un blocco termico a secco (Rocker Sahara 320 dry bath heat block, Rocker Scientific, Taiwan), inizialmente a 37°C per 60 min, seguito da una seconda incubazione a 95°C per 5 min per inattivare miScript RT. Successivamente, la miscela di reazione è stata conservata a -80°C. La determinazione quantitativa del miR-223 maturo è stata effettuata utilizzando saggi primer miScript specifici per il target con kit commerciali (miScript SYBR Green real-time PCR Kit, Qiagen, Germania), secondo le istruzioni del produttore. L'RNU6B umano (RNU6-2) è stato utilizzato come gene di riferimento. Dopo il passo iniziale di attivazione della HotStar Taq DNA Polymerase per 15 min a 95°C, le reazioni di PCR in tempo reale sono state eseguite per 40 cicli ciascuno di denaturazione per 15 s a 95°C, annealing per 30 s a 55°C ed estensione per 30 s a 70°C. Il software della piattaforma Stratagene Mx3005P (Agilent Technologies, USA) è stato utilizzato per determinare il valore del ciclo soglia (Ct). La formula del metodo delta-delta Ct è stata utilizzata per stimare le variazioni di espressione del miR-223.

- Fase di intervento per pazienti con AR indotta da HDM Protocollo di Immunoterapia Sublinguale (SLIT) I pazienti hanno ricevuto SLIT giornaliera standardizzata contenente estratti di HDM per un periodo di sei mesi. La somministrazione è iniziata sotto supervisione clinica e i pazienti sono stati monitorati mensilmente per l'aderenza e gli effetti avversi. La risposta terapeutica è stata valutata dopo sei mesi basandosi su un esito composito: una riduzione di almeno il 30% nel punteggio combinato di sintomi e farmaci, miglioramento nei punteggi TNSS e VAS e una diminuzione dei livelli sierici di sST2. I pazienti che soddisfavano questi criteri sono stati classificati come responder; quelli che non raggiungevano la soglia sono stati considerati non responder.