Surowicze sST2/miR-223 jako podwójny biomarker aktywności choroby i skuteczności klinicznej SLIT w alergicznym nieżycie nosa wywołanym przez roztocza kurzu domowego

SST2 rozpuszczalne (sST2), receptor pułapka interleukiny-33 (IL-33), zaangażowany w zapalenie alergiczne.
Cele: Badanie to analizowało surowicze sST2 jako biomarker aktywności choroby i do przewidywania odpowiedzi klinicznej na immunoterapię podjęzykową (SLIT) u pacjentów z alergicznym nieżytem nosa (AR) wywołanym przez roztocza kurzu domowego (HDM).

Etap 1: Badanie kliniczno-kontrolne przeprowadzone przez 3 miesiące w Katedrze Mikrobiologii Medycznej i Immunologii Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu w Zagazigu, we współpracy z Jednostką Alergologiczną Szpitali Uniwersyteckich w Zagazigu, od lutego do maja 2025 r.
Etap 2: Badanie interwencyjne (quasi eksperymentalne) dla pacjentów z umiarkowanym do ciężkiego AR (MSAR): przeprowadzone przez 6 miesięcy.

Populacja badana, kryteria włączenia i wykluczenia. Uprawnieni uczestnicy mieli 14 lat lub więcej, z diagnozą AR wywołanego przez HDM zgodnie z wytycznymi ARIA (Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma).
Pacjenci musieli mieć utrzymujące się umiarkowane do ciężkich objawy przez co najmniej dwa lata oraz być gotowi do rozpoczęcia i kontynuowania SLIT przez sześć miesięcy.
Kryteria wykluczenia obejmowały obecność chorób autoimmunologicznych lub przewlekłych stanów zapalnych, ciężką astmę lub inne choroby płuc, terapię ogólnoustrojowymi kortykosteroidami lub lekami immunosupresyjnymi w ciągu czterech tygodni przed rekrutacją, ciążę lub laktację oraz odmowę wyrażenia świadomej zgody.
Zdrowi, dopasowani wiekowo i płciowo, bez historii choroby alergicznej i z negatywnymi wynikami testu skórnego (SPT) zostali zrekrutowani jako grupa kontrolna.

Wielkość próby:

Wielkość próby została obliczona przy użyciu oprogramowania Open Epi Info, na podstawie następujących średnich poziomów sST2: wśród przypadków AR vs kontrola 19,8 ± 7,5 vs 14,3 ± 6,9
(ref.) przy mocy badania 80%, przedziale ufności 95%, stosunku przypadków do kontroli 1:1. Minimalna wymagana wielkość próby wynosiła 27 uczestników na grupę.
Jednak udało się zrekrutować 54 uczestników w każdej grupie, a wszyscy zostali uwzględnieni w ostatecznej analizie.
Uczestnicy zostali wybrani przy użyciu techniki prostego losowania zgodnie z wcześniej zdefiniowanymi kryteriami włączenia.

• Procedury kliniczne i laboratoryjne
• Ocena wyjściowa. Wszyscy uczestnicy przeszli szczegółową ocenę kliniczną, obejmującą dane demograficzne, czas trwania choroby, wskaźnik masy ciała (BMI) oraz historię wcześniejszego leczenia.
• Ocena objawów. Nasilenie objawów oceniano za pomocą TNSS, który obejmuje cztery parametry: wyciek z nosa, przekrwienie błony śluzowej nosa, świąd nosa i kichanie, każdy oceniany w skali od 0 do 4, co daje maksymalny wynik 16.
  Do ilościowej oceny ogólnego obciążenia objawami wykorzystano również 10-centymetrową Wizualną Skalę Analogową (VAS).
• Test skórny (SPT). SPT wykonano przy użyciu standaryzowanych ekstraktów alergenowych, w tym Dermatophagoides pteronyssinus i D. farinae.
  Histamina i sól fizjologiczna służyły odpowiednio jako kontrola pozytywna i negatywna.
  Za wynik dodatni uznano średnicę bąbla ≥3 mm w porównaniu z kontrolą negatywną.
• Oznaczenie markerów immunologicznych i sST2. Próbki krwi żylnej pobrano od wszystkich uczestników na początku badania w celu oznaczenia eozynofilii w surowicy, całkowitego poziomu immunoglobuliny E (IgE) oraz swoistego dla roztoczy kurzu domowego HDM-IgE (kU/l) metodą testu immunoenzymatycznego (ELISA) zgodnie z protokołem producenta (Chemus Bioscience, USA).

Stężenia sST2 oznaczono przy użyciu komercyjnego zestawu ELISA (Elabscience, nr kat. E-EL-H6082).
U pacjentów poddawanych SLIT dodatkowe próbki surowicy pobrano po sześciu miesiącach terapii.
Wszystkie pomiary wykonano w duplikacie.
Personel laboratoryjny przeprowadzający oznaczenia nie miał dostępu do informacji klinicznych i czasu pobrania próbek.

- Wykrywanie poziomu ekspresji mikroRNA-223 za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR): MikroRNA wyizolowano przy użyciu komercyjnych zestawów miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen, Niemcy), zgodnie z instrukcją producenta.
Po ekstrakcji mikroRNA poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu zestawów do odwrotnej transkrypcji (miScript II RT Kit, Qiagen, Niemcy) zgodnie z instrukcją producenta.
Następnie inkubowano je w suchym bloku grzejnym (Rocker Sahara 320 dry bath heat block, Rocker Scientific, Tajwan), początkowo w 37°C przez 60 minut, a następnie w drugiej inkubacji w 95°C przez 5 minut w celu inaktywacji miScript RT.
Po tym mieszaninę reakcyjną przechowywano w -80°C. Ilościowe oznaczanie dojrzałego miR-223 przeprowadzono przy użyciu specyficznych starterów miScript Primer Assays z komercyjnymi zestawami (miScript SYBR Green real-time PCR Kit, Qiagen, Niemcy), zgodnie z instrukcją producenta.
Jako gen referencyjny użyto ludzkiego RNU6B (RNU6-2).
Po wstępnej aktywacji HotStar Taq DNA Polymerase przez 15 minut w 95°C, reakcje PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przez 40 cykli, z których każdy obejmował denaturację przez 15 s w 95°C, hybrydyzację przez 30 s w 55°C i elongację przez 30 s w 70°C.
Do określenia wartości cyklu progowego (Ct) użyto oprogramowania platformy Stratagene Mx3005P (Agilent Technologies, USA).
Do oszacowania zmian w ekspresji miR-223 wykorzystano wzór metody delta-delta Ct.

- Etap interwencji dla pacjentów z MSAR. Protokół immunoterapii podjęzykowej (SLIT). Pacjenci otrzymywali standaryzowaną codzienną SLIT zawierającą ekstrakty HDM przez okres sześciu miesięcy.
Podawanie rozpoczęto pod nadzorem klinicznym, a pacjenci byli monitorowani miesięcznie pod kątem przestrzegania zaleceń i działań niepożądanych.
Odpowiedź terapeutyczną oceniano po sześciu miesiącach na podstawie złożonego wyniku: redukcji o co najmniej 30% w łącznym wyniku objawów i leków, poprawy w punktacji TNSS i VAS oraz spadku poziomów sST2 w surowicy.
Pacjenci spełniający te kryteria zostali sklasyfikowani jako odpowiadający na leczenie; ci, którzy nie osiągnęli progu, zostali uznani za nieodpowiadających.