Serum sST2/ miR-223 som en dobbelt biomarkør for sygdomsaktivitet & klinisk effekt af SLIT ved husstøvmide-induceret allergisk rhinitis

Soluble suppression of tumorigenicity 2 (sST2), en afledningsreceptor for interleukin-33 (IL-33), involveret i allergisk inflammation. Mål: Denne undersøgelse undersøgte serum sST2 som en biomarkør for sygdomsaktivitet og for at forudsige klinisk respons på sublingual immunterapi (SLIT) hos patienter med husstøvmide (HDM) induceret AR.

1. fase: En case-control undersøgelse udført over 3 måneder på Afdelingen for Medicinsk Mikrobiologi og Immunologi, Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Zagazig Universitet, i samarbejde med Allergienheden på Zagazig Universitetshospitaler fra februar til maj 2025. 2. fase: En interventionsundersøgelse (kvasi-eksperimentel) for (MSAR-patienter): udført over 6 måneder.

Undersøgelsespopulation, inklusions- og eksklusionskriterier: Berettigede deltagere var 14 år eller ældre med en diagnose af HDM-induceret AR og dens indvirkning på astma (ARIA) retningslinjer. Patienter skulle have vedvarende moderate til svære symptomer i mindst to år og være villige til at påbegynde og opretholde SLIT i seks måneder. Eksklusionskriterier inkluderede tilstedeværelse af autoimmune eller kroniske inflammatoriske tilstande, svær astma eller anden lungesygdom, systemisk kortikosteroid eller immunosuppressiv terapi inden for fire uger før indmelding, graviditet eller amning, og nægtelse af at give informeret samtykke. Sunde, alders- og kønsmatchede personer uden historie for allergisk sygdom og med negative priktestresultater (SPT) blev rekrutteret som kontrolgruppe.

Stikprøvestørrelse:

Stikprøvestørrelsen blev beregnet ved hjælp af open epi info i henhold til følgende: gennemsnitligt sST2-niveau blandt AR-tilfælde versus kontrol var 19,8±7,5 versus 14,3±6,9 (ref.) ved undersøgelsens styrke på 80%, ci 95%, case: kontrol 1:1. Den mindst nødvendige stikprøvestørrelse var 27 deltagere pr. gruppe. Vi var dog i stand til at rekruttere 54 deltagere i hver gruppe, som alle blev inkluderet i den endelige analyse. Deltagerne blev udvalgt ved hjælp af en simpel tilfældig udvælgelsesteknik i henhold til de foruddefinerede inklusionskriterier.

• Kliniske og laboratorieprocedurer
• Baselinevurdering: Alle deltagere gennemgik en detaljeret klinisk vurdering, inklusive demografiske data, sygdomsvarighed, body mass index (BMI) og tidligere behandlingshistorie.
• Symptomscoring: Symptomsværhed blev evalueret ved hjælp af TNSS, som inkluderer fire parametre - rhinoré, næsetilstop, næsekløe og nys - hver vurderet på en skala fra 0 til 4, for en maksimal score på 16. En 10 cm visuel analog skala (VAS) blev også brugt til at kvantificere den samlede symptombyrde.
• Prikkeprøve (SPT): SPT blev udført ved hjælp af standardiserede allergenextrakter, inklusive Dermatophagoides pteronyssinus og D. farinae. Histamin og saltvand tjente som henholdsvis positiv og negativ kontrol. En hævelsesdiameter på ≥3 mm sammenlignet med den negative kontrol blev betragtet som positiv.
• Immunologisk markør og sST2-måling: Venøse blodprøver blev indsamlet fra alle deltagere ved baseline for at bestemme serum eosinofiler, totale immunoglobulin E (IgE) niveauer og husstøvmide-specifik HDM-IgE (kU/l) målt ved enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) i henhold til producentens protokol (Chemus Bioscience, USA).

sST2-koncentrationer blev kvantificeret ved hjælp af et kommercielt ELISA-kit (Elabscience, Kat. nr. E-EL-H6082). For patienter, der gennemgik SLIT, blev yderligere serumprøver indsamlet efter seks måneders terapi. Alle målinger blev udført i duplikat. Laboratoriepersonale, der udførte analyserne, var blindet for den kliniske information og prøvetagningstidspunktet.

- Detektion af microRNA-223 ekspressionsniveau via kvantitativ polymerasekædereaktion (qRT-PCR): MicroRNA blev ekstraheret ved hjælp af kommercielle miRNeasy Serum/Plasma Kits (Qiagen, Tyskland), i henhold til producentens instruktioner. Efter ekstraktion blev microRNA reversibelt transskriberet ved hjælp af revers transskriptionskits (miScript II RT Kit, Qiagen, Tyskland) i henhold til producentens instruktioner. Derefter blev det inkuberet i et tørbadsblok (Rocker Sahara 320 tørbads varmeblok, Rocker Scientific, Taiwan), først ved 37°C i 60 min, efterfulgt af en anden inkubering ved 95°C i 5 min for at inaktivere miScript RT. Derefter blev reaktionsblandingen opbevaret ved -80°C. Kvantitativ bestemmelse af moden miR-223 blev udført ved hjælp af targetspecifikke miScript Primer Assays ved hjælp af kommercielle kits (miScript SYBR Green real-time PCR Kit, Qiagen, Tyskland), i henhold til producentens instruktioner. Humant RNU6B (RNU6-2) blev brugt som husreferencegen. Efter det indledende aktiveringsstep for HotStar Taq DNA Polymerase i 15 min ved 95°C, blev real-time PCR-reaktionerne kørt i 40 cyklusser, hver bestående af en denaturering i 15 s ved 95°C, annealing i 30 s ved 55°C og forlængelse i 30 s ved 70°C. Stratagene Mx3005P-platformsoftwaren (Agilent Technologies, USA) blev brugt til at beregne tærskelcyklusværdien (Ct). Delta-delta Ct-metodeformlen blev anvendt til at estimere fold-ændringerne i miR-223-ekspression.

- Interventionsfase for (MSAR-patienter) Sublingual Immunoterapi (SLIT) Protokol: Patienter modtog standardiseret daglig SLIT indeholdende HDM-ekstrakter i en periode på seks måneder. Administrationen startede under klinisk tilsyn, og patienter blev overvåget månedligt for overholdelse og bivirkninger. Den terapeutiske respons blev evalueret efter seks måneder baseret på et sammensat udfald: en reduktion på mindst 30% i den kombinerede symptom- og medicinscore, forbedring i TNSS- og VAS-scorer og et fald i serum sST2-niveauer. Patienter, der opfyldte disse kriterier, blev klassificeret som respondenter; dem, der ikke opnåede tærsklen, blev betragtet som ikke-respondenter.