Neuartige Assays zum Nachweis des Influenzavirus

I. Hintergrund

• Das saisonale Influenzavirus verursacht schätzungsweise 0,3 bis 0,6 Millionen Todesfälle pro Jahr. Die Vogelgrippeviren H5N1, H7N9 und H5N6 haben eine Sterblichkeitsrate von über 30 %. Schweinegrippeviren von Schweinen haben auch Menschen infiziert.
• Molekulare Assays werden heute routinemäßig beim Nachweis von Influenzaviren eingesetzt. Das M-Gen wird häufig als Ziel für alle Influenza-A-Viren verwendet, da die Nukleotidsequenz dieses Gens unter allen Influenza-A-Viren relativ konserviert ist. Die Weltgesundheitsorganisation und die US-amerikanischen Centers for Disease Control and Prevention (CDC) haben Protokolle zum molekularen Nachweis des M-Gens des Influenza-A-Virus veröffentlicht.
• Jüngste Studien haben jedoch gezeigt, dass Mutationen im M-Gen zu einer verringerten Empfindlichkeit des RT-PCR-Assays geführt haben, der auf dieses Gen abzielt. Daher ist es wichtig, alternative konservierte Gene als Ziel der RT-PCR zu verwenden. In dieser Studie ist es unser Ziel, zwei neue RT-PCR-Assays zu evaluieren, die auf PB2- und NS-Gensegmenten basieren

II. Studienziel -Bewertung der Sensitivität und Spezifität von 2 neuen RT-PCR-Assays

III. Allgemeines Studiendesign

• Die Ermittler entnehmen nach dem Zufallsprinzip archivierte Nasen-Rachen- und Speichelproben, die zuvor mit handelsüblichen Assays in unserem Labor auf das Influenza-A-Virus getestet und in der Public Health Laboratory Service Branch in Hongkong auf das Influenza-A-Virus getestet wurden. Diese Proben werden mit 4 verschiedenen RT-PCR-Assays, wie unten aufgeführt, auf das Influenza-A-Virus getestet:

  1. Unser neuer RT-PCR-Assay zielt auf das PB2-Gen ab
  2. Unser neuer RT-PCR-Assay zielt auf das NS-Gen ab
  3. M-Gen-RT-PCR, veröffentlicht von der Weltgesundheitsorganisation

  4. M-Gen-RT-PCR, veröffentlicht von der US CDC

     Sensitivität, Spezifität, positiver Vorhersagewert und negativer Vorhersagewert werden bestimmt.

     IV. Nukleinsäureextraktion und Echtzeit-Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) für das Influenza-A-Virus

• Speichel- und Nasopharynxproben werden einer Gesamtnukleinsäure (TNA)-Extraktion durch NucliSENS easyMAG (BioMerieux, Boxtel, Niederlande) unterzogen.
• Es werden Monoplex-Echtzeit-RT-PCR-Assays für das Influenza-A-Virus durchgeführt. Die Primer und Sonden für die M-Gen-RT-PCR wurden von der WHO und der US CDC veröffentlicht.

V. Stichprobengröße:

• Die Ermittler werden alle 4 RT-PCR-Assays an insgesamt 320 Proben durchführen, einschließlich
• 80 nasopharyngeale Proben, die durch im Handel erhältliche molekulare Assays oder durch Tests, die in der Public Health Laboratory Services Branch in Hongkong durchgeführt wurden, positiv auf Influenza A getestet wurden
• 80 nasopharyngeale Proben, die durch im Handel erhältliche molekulare Assays oder durch Tests, die in der Public Health Laboratory Services Branch in Hongkong durchgeführt wurden, negativ auf Influenza A getestet wurden
• 80 Speichelproben, die durch im Handel erhältliche molekulare Assays positiv auf Influenza A getestet wurden
• 80 Speichelproben, die mit handelsüblichen molekularen Assays negativ auf Influenza A getestet wurden