Novos ensaios para detecção do vírus da gripe

I. Antecedentes

• O vírus da gripe sazonal causa cerca de 0,3 a 0,6 milhões de mortes por ano. Vírus da gripe aviária H5N1, H7N9 e H5N6 tem taxa de mortalidade de mais de 30%. Os vírus da gripe suína de porcos também infectaram humanos.
• Ensaios moleculares agora são usados ​​rotineiramente na detecção de vírus influenza. O gene M é frequentemente usado como alvo para todos os vírus influenza A porque a sequência de nucleotídeos desse gene é relativamente conservada entre todos os vírus influenza A. A Organização Mundial da Saúde e os Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) dos EUA publicaram protocolos para detecção molecular do gene M do vírus influenza A.
• No entanto, estudos recentes mostraram que mutações no gene M levaram a uma sensibilidade reduzida do ensaio de RT-PCR direcionado a esse gene. Portanto, é importante usar genes conservados alternativos como alvo de RT-PCR. Neste estudo, nosso objetivo é avaliar dois novos ensaios de RT-PCR baseados no segmento gênico PB2 e NS

II. Objetivo do estudo - Avaliar a sensibilidade e especificidade de 2 novos ensaios de RT-PCR

III. Desenho geral do estudo

• Os investigadores irão recuperar aleatoriamente amostras arquivadas de nasofaringe e saliva que foram previamente testadas para o vírus influenza A usando ensaios comercialmente disponíveis em nosso laboratório, testados para o vírus influenza A no Public Health Laboratory Service Branch em Hong Kong. Essas amostras serão testadas para o vírus influenza A por 4 ensaios diferentes de RT-PCR, conforme listado abaixo:

  1. Nosso novo ensaio de RT-PCR direcionado ao gene PB2
  2. Nosso novo ensaio de RT-PCR direcionado ao gene NS
  3. RT-PCR do gene M publicado pela Organização Mundial da Saúde

  4. RT-PCR do gene M publicado pelo CDC dos EUA

     Sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo serão determinados.

     4. Extração de ácido nucleico e reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) para o vírus influenza A

• Amostras de saliva e nasofaringe serão submetidas à extração de ácido nucleico total (TNA) por NucliSENS easyMAG (BioMerieux, Boxtel, Holanda).
• Serão realizados ensaios monoplex de RT-PCR em tempo real para o vírus influenza A. Os primers e sondas para o gene M RT-PCR foram publicados pela OMS e pelo CDC dos EUA.

V. Tamanho da amostra:

• Os investigadores realizarão todos os 4 ensaios de RT-PCR em um total de 320 amostras, incluindo
• 80 amostras nasofaríngeas com resultado positivo para influenza A por ensaios moleculares disponíveis comercialmente ou por testes realizados no Public Health Laboratory Services Branch em Hong Kong
• 80 espécimes nasofaríngeos com resultados negativos para influenza A por ensaios moleculares disponíveis comercialmente ou por testes realizados no Public Health Laboratory Services Branch em Hong Kong
• 80 amostras de saliva que testaram positivo para influenza A por ensaios moleculares disponíveis comercialmente
• 80 amostras de saliva com resultado negativo para influenza A por ensaios moleculares disponíveis comercialmente