Personalisiertes Risiko einer schnell fortschreitenden Atherosklerose (RPA)

Studiendesign: offene kontinuierliche retrospektive und prospektive Studie nach Parallelgruppenmethode.

In der Dissertationsarbeit wurden drei Kontrollpunkte definiert: Der erste Punkt war retrospektiv, 2 Jahre vor der Studie; der zweite war der Tag der Aufnahme in die Studie; und die dritte war 12 Monate nach der Aufnahme.

Der retrospektive Zeitpunkt umfasste 2 Jahre ab dem Datum des Patienteneinschlusses in die Studie (Zeitraum von Januar 2019 bis Januar 2021) mit der Bestimmung eines großen Spektrums von Parametern klinischer, instrumenteller und labortechnischer Art, die potenziell das Auftreten und den Verlauf der Atherosklerose beeinflussen (gem die Literaturanalyse). Die genannten Untersuchungen wurden zu zwei Zeitpunkten durchgeführt und ausgewertet: die erste - zum Zeitpunkt des ersten vorangegangenen Koronarereignisses während der zweijährigen Retrospektive, die zweite - zum Zeitpunkt des Einschlusses des Patienten in die vorliegende Studie. 202 Patienten wurden in zwei Gruppen eingeteilt.

Studienmethoden. Zum Zeitpunkt der Aufnahme (1 Punkt) in die Studie wurden alle Patienten einer allgemeinen klinischen Untersuchung mit Beurteilung der Beschwerden und des klinischen Zustands, einer Laboruntersuchung mit allgemeinen und biochemischen Bluttests, einschließlich einer speziellen biochemischen Untersuchung des Blutserums zur Bestimmung des Grads der Hochempfindlichkeit unterzogen C-reaktives Protein (CRP, mg/L) und Lipidspektrum, einschließlich Gesamtcholesterin (GC, mmol/L), Low-Density-Lipoproteine ​​(LDL, mmol/L), High-Density-Lipoproteine ​​(HDL, mmol/L), Triglyceride (TG, mmol/l); Urinanalyse und instrumentelle Untersuchungen: Elektrokardiografie (EKG), Echokardiografie (Echo-CG), R-Aufnahme der Brustorgane, selektive Koronarangiografie Neben den Standarduntersuchungsmethoden werden bei allen Patienten molekulargenetische Parameter bestimmt. Standarduntersuchungsmethoden werden nach einem Jahr wiederholt (2 Punkte).

Herstellung von DNA-Präparationen. Die DNA-Extraktion aus Blut wurde durch Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt. 5 bis 6 Volumina Puffer A (10 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 10 mM NaCl; 3 mM MgCl 2 ) wurden zu 1 Volumen Blutprobe gegeben und Gerinnsel wurden in einem Homogenisator gerieben. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 2500 g wurden die Präzipitate dreimal mit Puffer A gewaschen und in 1 ml Puffer B (10 mM EDTA; 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) resuspendiert. Nach Zugabe von SDS auf 0,5 % und Proteinase E auf 200 &mgr;g/ml wurde die Mischung für 12 Stunden bei 56°C inkubiert. Die Deproteinisierung wurde nacheinander mit Phenol-Chloroform-Mischung (1:1), wassergesättigtem Phenol, Phenol-Chloroform-Mischung (1:1) und Chloroform durchgeführt. Die DNA wurde durch Zugabe von NaCl-Lösung zu 1 M und 1 V Isopropylalkohol ausgefällt. Danach wurde die Lösung für 1 h bei –20°C gekühlt. Der durch 15-minütiges Zentrifugieren auf einer Eppendorf-Mikrozentrifuge bei 12000 g erhaltene Niederschlag wurde dreimal mit 75 % Ethanol gewaschen, gefolgt von 5-minütigem Zentrifugieren. 12000 g und nach dem Trocknen bei 56 °C in deinanilisiertem Wasser auf eine DNA-Konzentration von 0,5 µg/µl gelöst. Die Genotypisierung der Polymorphismen wurde mittels Real-Time-PCR gemäß dem Protokoll des Herstellers (TaqMan-Sonden, Thermo Fisher Scientific, USA) durchgeführt ein StepOnePlus-Instrument. Sie wurden nach den Ergebnissen internationaler vollständiger genomweiter Assoziationsstudien (GWAS) ausgewählt, die die Assoziation dieser SNPs mit der koronaren Herzkrankheit (KHK) bestätigten, einem entzündlichen Prozess, der eine bedeutende Rolle beim Fortschreiten der Atherosklerose spielt.

Methoden der statistischen Analyse. Das Softwarepaket SPSS 22.0 wird für die statistische Analyse molekulargenetischer Daten verwendet. In einem ersten Schritt werden die Häufigkeiten von Genotypen und Allelen der untersuchten SNPs in der Gruppe der Myokardinfarktpatienten mit erhöhten Werten kardiospezifischer Marker und der Vergleichsgruppe bestimmt, in der kardiospezifische Marker innerhalb normaler Grenzen liegen; dann werden wir die Übereinstimmung der Genotypfrequenzen mit dem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht in der Kontrollgruppe (unter Verwendung des Chi-Quadrat-Kriteriums) bewerten. Es wird ein Vergleich der Niveaus von Indikatoren wie Alter; Kreatininspiegel; diagnostische Ebene von Biomarkern der Myokardnekrose: MB-Kreatinkinase und Troponin, Fettsäure-bindendes Protein (FABP); Body-Mass-Index; Taillenumfang; Serum-C-Peptid-Konzentration; Glykämiewerte bei Aufnahme und Entlassung; Bluthämoglobinspiegel bei Aufnahme und Entlassung; Systolischer und diastolischer Blutdruck bei Aufnahme; Herzfrequenz bei Aufnahme; Wert der linksventrikulären Ejektionsfraktion durch Echokardiographie; Serum-HCMP-Konzentration; Lipidogramm: Serumkonzentration von Low-Density-Lipoproteinen (LDL), High-Density-Lipoproteinen (HDL), Gesamtcholesterin, Triglyceride; Größe, Gewicht, Body-Mass-Index, bei Trägern verschiedener Genotypen wurden durchgeführt, nachdem die Normalverteilung dieser Merkmale durch den Kolmogorov-Smirnov-Test überprüft worden war. Wenn die Merkmale die Kriterien der Normalverteilung erfüllen würden, würde eine Einzelfaktor-Varianzanalyse verwendet werden. Die Signifikanz von Unterschieden zwischen zwei genotypischen Klassen wird zusätzlich mit dem t-Test für zwei unabhängige Stichproben überprüft. Wenn ein zu untersuchendes Merkmal die Kriterien der Normalverteilung nicht erfüllt, wird der Vergleich des Niveaus dieses Merkmals bei Trägern verschiedener Genotypen unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests durchgeführt; die Zuverlässigkeit der Unterschiede zwischen den beiden genotypischen Klassen wird zusätzlich mit dem Mann-Whitney-Test für zwei unabhängige Stichproben überprüft. Die Assoziation von SNPs mit Risikofaktoren im Zusammenhang mit kategorialen Variablen wird mit Konjugationstabellen unter Verwendung des Pearson-Chi-Quadrat-Tests getestet. Im Fall von Tabellen mit vier Feldern wird beim Vergleich von Proben nach Genotyp und Allelhäufigkeiten das exakte zweiseitige Kriterium von Fisher verwendet. Das relative Risiko (OR – Odds Ratio) des Krankheitsausgangs/Risikofaktorvorliegens für ein bestimmtes Allel oder Genotyp wird als Odds Ratio berechnet.

Der Einfluss klinischer, demographischer, funktioneller, metabolischer, entzündlicher Parameter und Myokardnekrose-Marker auf die Langzeitprognose wird anhand der Odds Ratio (0,95 Konfidenzintervall) bewertet.