Персонализированный риск быстро прогрессирующего атеросклероза (RPA)

Дизайн исследования: открытое непрерывное ретроспективное и проспективное исследование методом параллельных групп.

В диссертационной работе были определены три контрольные точки: первая точка ретроспективная, за 2 года до исследования; второй – день включения в исследование; а третий – через 12 месяцев после включения.

Ретроспективная точка охватывала 2 года с момента включения пациентов в исследование (период с января 2019 г. по январь 2021 г.) с определением большого спектра показателей клинического, инструментального, лабораторного характера, потенциально влияющих на возникновение и прогрессирование атеросклероза (по данным анализ литературы). Указанные исследования проводились и оценивались в двух точках: первая - на момент первого предшествующего коронарного события в течение двухлетнего ретроспективного периода, вторая - на момент включения пациента в настоящее исследование. 202 пациента были разделены на две группы.

Методы исследования. На момент включения (1 балл) в исследование всем пациентам проводилось общеклиническое обследование с оценкой жалоб и клинического статуса, лабораторное обследование с общим и биохимическим анализами крови, в том числе специальное биохимическое исследование сыворотки крови для определения уровня высокочувствительного С-реактивный белок (СРБ, мг/л) и липидный спектр, включая общий холестерин (ГХ, ммоль/л), липопротеины низкой плотности (ЛПНП, ммоль/л), липопротеиды высокой плотности (ЛПВП, ммоль/л), триглицериды (ТГ, ммоль/л); общий анализ мочи и инструментальные исследования: электрокардиография (ЭКГ), эхокардиография (Эхо-КГ), R-графия органов грудной клетки, селективная коронароангиография Помимо стандартных методов исследования, у всех больных будут определяться молекулярно-генетические параметры. Стандартные методы исследования повторяют через год (2 балла).

Приготовление препаратов ДНК. Выделение ДНК из крови проводили фенол-хлороформной экстракцией. К 1 объему образца крови добавляли 5–6 объемов буфера А (10 мМ Tris-HCl, pH=7,5; 10 мМ NaCl; 3 мМ MgCl2) и сгустки растирали в гомогенизаторе. После центрифугирования при 2500g в течение 15 мин осадки трижды промывали буфером А и ресуспендировали в 1 мл буфера Б (10 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, рН 8,5). После добавления SDS до 0,5% и протеиназы Е до 200 мкг/мл смесь инкубировали 12 часов при 56°С. Депротеинизацию проводили последовательно фенол-хлороформной смесью (1:1), водонасыщенным фенолом, фенол-хлороформной смесью (1:1) и хлороформом. ДНК осаждали добавлением раствора NaCl к 1 M и 1 V изопропиловому спирту. После этого раствор охлаждали в течение 1 ч при -20°С. Осадок, полученный центрифугированием на микроцентрифуге Eppendorf при 12000 g в течение 15 мин, трижды промывали 75%-ным этанолом с последующим центрифугированием в течение 5 мин. 12000 г и после высушивания при 56 °С растворяли в дезинанилированной воде до концентрации ДНК 0,5 мкг/мкл. Генотипирование полиморфизмов проводили методом ПЦР в реальном времени по протоколу производителя (зонды TaqMan, Thermo Fisher Scientific, США) на инструмент StepOnePlus. Они были отобраны по результатам международных полногеномных ассоциативных исследований (GWAS), подтвердивших ассоциацию этих SNP с ишемической болезнью сердца (ИБС) — воспалительным процессом, играющим значительную роль в прогрессировании атеросклероза.

Методы статистического анализа. Пакет программ SPSS 22.0 будет использоваться для статистического анализа молекулярно-генетических данных. На первом этапе будут определены частоты генотипов и аллелей изучаемых SNP в группе больных инфарктом миокарда с повышенными значениями кардиоспецифических маркеров и группе сравнения, где кардиоспецифические маркеры будут в пределах нормы; затем оценим соответствие частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга в контрольной группе (используя критерий хи-квадрат). Произойдет сравнение уровней таких показателей, как возраст; уровень креатинина; диагностический уровень биомаркеров некроза миокарда: MB креатинкиназы и тропонина, белка, связывающего жирные кислоты (FABP); индекс массы тела; обхват талии; концентрация С-пептида в сыворотке крови; уровни гликемии при поступлении и выписке; уровень гемоглобина в крови при поступлении и выписке; Систолическое и диастолическое артериальное давление при поступлении; частота сердечных сокращений при поступлении; значение фракции выброса левого желудочка по данным эхокардиографии; концентрация HCMP в сыворотке; липидограмма: сывороточная концентрация липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), общего холестерина, триглицеридов; рост, массу тела, индекс массы тела у носителей разных генотипов определяли после проверки нормальности распределения этих признаков по критерию Колмогорова-Смирнова. Если признаки будут соответствовать критериям нормального распределения, будет использоваться однофакторный дисперсионный анализ. Значимость различий между двумя генотипическими классами будет дополнительно проверена с помощью t-критерия для двух независимых выборок. Если изучаемый признак не соответствует критериям нормального распределения, сравнение уровня этого признака у носителей разных генотипов будет производиться с помощью теста Крускала-Уоллиса; достоверность различий между двумя генотипическими классами будет дополнительно проверена с помощью критерия Манна-Уитни для двух независимых выборок. Связь SNP с факторами риска, связанными с категориальными переменными, будет проверена с помощью таблиц сопряжения с использованием критерия хи-квадрат Пирсона. В случае таблиц с четырьмя полями сравнение выборок по частотам генотипа и аллеля будет использовать точный двусторонний критерий Фишера. Относительный риск (ОШ - отношение шансов) исхода заболевания/наличия фактора риска для конкретного аллеля или генотипа будет рассчитываться как отношение шансов.

Влияние клинических, демографических, функциональных, метаболических, воспалительных параметров и маркеров некроза миокарда на долгосрочный прогноз будет оцениваться по отношению шансов (доверительный интервал 0,95).