Spersonalizowane ryzyko szybko postępującej miażdżycy (RPA)

Projekt badania: otwarte ciągłe retrospektywne i prospektywne badanie metodą grup równoległych.

W pracy doktorskiej zdefiniowano trzy punkty kontrolne: pierwszy punkt był retrospektywny, 2 lata przed badaniem; drugim był dzień włączenia do badania; a trzeci był 12 miesięcy po włączeniu.

Punkt retrospektywny obejmował 2 lata od daty włączenia pacjenta do badania (okres od stycznia 2019 do stycznia 2021) z określeniem szerokiego spektrum parametrów o charakterze klinicznym, instrumentalnym, laboratoryjnym potencjalnie wpływających na pojawienie się i progresję miażdżycy (wg. analiza literatury). Wymienione badania wykonano i oceniono w dwóch punktach: pierwszym – w momencie wystąpienia pierwszego poprzedzającego incydentu wieńcowego w dwuletniej retrospektywie, drugim – w momencie włączenia chorego do niniejszego badania. 202 pacjentów podzielono na dwie grupy.

Metody nauki. W momencie włączenia (1 punkt) do badania u wszystkich pacjentów wykonano ogólne badanie kliniczne z oceną dolegliwości i stanu klinicznego, badanie laboratoryjne z badaniami ogólnymi i biochemicznymi krwi, w tym specjalne badanie biochemiczne surowicy krwi w celu określenia poziomu wysokiej czułości Białko C-reaktywne (CRP, mg/l) i lipidy, w tym cholesterol całkowity (GC, mmol/l), lipoproteiny o małej gęstości (LDL, mmol/l), lipoproteiny o dużej gęstości (HDL, mmol/l), trójglicerydy (TG, mmol/l); badanie moczu i instrumentalne: elektrokardiografia (EKG), echokardiografia (Echo-CG), R-grafia narządów klatki piersiowej, selektywna angiografia wieńcowa Oprócz standardowych metod badawczych u wszystkich pacjentów zostaną określone parametry genetyki molekularnej. Standardowe metody badania zostaną powtórzone po roku (2 punkty).

Przygotowanie preparatów DNA. Ekstrakcję DNA z krwi przeprowadzono metodą ekstrakcji fenolem-chloroformem. Pięć do sześciu objętości buforu A (10 mM Tris-HCl, pH=7,5; 10 mM NaCl; 3 mM MgCl2) dodano do 1 objętości próbki krwi i skrzepy roztarto w homogenizatorze. Po odwirowaniu przy 2500 g przez 15 min osad przemyto trzykrotnie buforem A i ponownie zawieszono w 1 ml buforu B (10 mM EDTA; 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH=8,5). Po dodaniu SDS do 0,5% i proteinazy E do 200 μg/ml, mieszaninę inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 56°C. Odbiałczenie prowadzono sekwencyjnie za pomocą mieszaniny fenol-chloroform (1:1), fenolu nasyconego wodą, mieszaniny fenol-chloroform (1:1) i chloroformu. DNA wytrącono przez dodanie roztworu NaCl do 1 M i 1 V alkoholu izopropylowego. Następnie roztwór schładzano przez 1 godzinę w temperaturze -20°C. Osad otrzymany przez odwirowanie na mikrowirówce Eppendorfa przy 12000 g przez 15 min przemyto trzykrotnie 75% etanolem, a następnie odwirowano przez 5 min. 12000 g i po wysuszeniu w 56 °C rozpuszczono w deinanizowanej wodzie do stężenia DNA 0,5 µg/µl. Genotypowanie polimorfizmów przeprowadzono metodą PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z protokołem producenta (sondy TaqMan, Thermo Fisher Scientific, USA) na instrument StepOnePlus. Zostały one wybrane zgodnie z wynikami międzynarodowych badań asocjacyjnych całego genomu (GWAS), które potwierdziły związek tych SNP z chorobą niedokrwienną serca (CHD), procesem zapalnym, który odgrywa znaczącą rolę w progresji miażdżycy.

Metody analizy statystycznej. Pakiet oprogramowania SPSS 22.0 będzie używany do analizy statystycznej danych molekularno-genetycznych. Pierwszym etapem będzie określenie częstości genotypów i alleli badanych SNP w grupie pacjentów z zawałem mięśnia sercowego z podwyższonymi wartościami markerów kardiospecyficznych oraz w grupie porównawczej, w której markery kardiospecyficzne będą mieścić się w granicach normy; następnie ocenimy zgodność częstości genotypów z równowagą Hardy'ego-Weinberga w grupie kontrolnej (za pomocą kryterium chi-kwadrat). Nastąpi porównanie poziomów wskaźników takich jak wiek; poziom kreatyniny; poziom diagnostyczny biomarkerów martwicy mięśnia sercowego: kinaza kreatynowa MB i troponina, białko wiążące kwasy tłuszczowe (FABP); wskaźnik masy ciała; obwód talii; stężenie peptydu C w surowicy; poziomy glikemii przy przyjęciu i wypisie; poziom hemoglobiny we krwi przy przyjęciu i wypisie; Skurczowe i rozkurczowe ciśnienie krwi przy przyjęciu; tętno przy przyjęciu; wartość frakcji wyrzutowej lewej komory w badaniu echokardiograficznym; stężenie HCMP w surowicy; lipidogram: stężenie lipoprotein o małej gęstości (LDL), lipoprotein o dużej gęstości (HDL) w surowicy, cholesterol całkowity, triglicerydy; wzrost, masę ciała, wskaźnik masy ciała u nosicieli różnych genotypów wykonano po sprawdzeniu normalności rozkładu tych cech testem Kołmogorowa-Smirnowa. Gdyby cechy spełniały kryteria rozkładu normalnego, zastosowano by jednoczynnikową analizę wariancji. Istotność różnic między dwiema klasami genotypowymi zostanie dodatkowo sprawdzona za pomocą testu t dla dwóch niezależnych próbek. Jeżeli badana cecha nie spełnia kryteriów rozkładu normalnego, porównanie poziomu tej cechy u nosicieli różnych genotypów zostanie przeprowadzone za pomocą testu Kruskala-Wallisa; wiarygodność różnic między dwiema klasami genotypowymi zostanie dodatkowo sprawdzona za pomocą testu Manna-Whitneya dla dwóch niezależnych prób. Powiązanie SNP z czynnikami ryzyka związanymi ze zmiennymi kategorycznymi zostanie przetestowane za pomocą tabel koniugacji przy użyciu testu chi-kwadrat Pearsona. W przypadku tabel czteropolowych porównanie próbek według genotypu i częstości alleli będzie korzystać z dokładnego dwustronnego kryterium Fishera. Względne ryzyko (OR – iloraz szans) wyniku choroby/obecności czynnika ryzyka dla określonego allelu lub genotypu zostanie obliczone jako iloraz szans.

Wpływ parametrów klinicznych, demograficznych, czynnościowych, metabolicznych, zapalnych i markerów martwicy mięśnia sercowego na długoterminowe rokowanie zostanie oceniony za pomocą ilorazu szans (przedział ufności 0,95).