Personalizované riziko rychle progresivní aterosklerózy (RPA)

Design studie: otevřená průběžná retrospektivní a prospektivní studie metodou paralelních skupin.

V dizertační práci byly definovány tři kontrolní body: první bod byl retrospektivní, 2 roky před studií; druhý byl den zařazení do studie; a třetí bylo 12 měsíců po zařazení.

Retrospektivní bod zahrnoval 2 roky od data zařazení pacienta do studie (období leden 2019 až leden 2021) se stanovením velkého spektra parametrů klinického, přístrojového, laboratorního charakteru potenciálně ovlivňujících vznik a progresi aterosklerózy (dle analýza literatury). Uvedená vyšetření byla provedena a hodnocena ve dvou bodech: první - v době první předchozí koronární příhody během dvouletého retrospektivního období, druhé - v době zařazení pacienta do této studie. 202 pacientů bylo rozděleno do dvou skupin.

Studijní metody. V okamžiku zařazení (1 bod) do studie všichni pacienti podstoupili celkové klinické vyšetření s posouzením obtíží a klinického stavu, laboratorní vyšetření s obecnými a biochemickými krevními testy, včetně speciálního biochemického vyšetření krevního séra ke stanovení úrovně vysoké citlivosti C-reaktivní protein (CRP, mg/L) a lipidové spektrum, včetně celkového cholesterolu (GC, mmol/L), lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL, mmol/L), lipoproteinů s vysokou hustotou (HDL, mmol/L), triglyceridy (TG, mmol/l); vyšetření moči a instrumentální vyšetření: elektrokardiografie (EKG), echokardiografie (Echo-CG), R-grafie hrudních orgánů, selektivní koronarografie U všech pacientů budou kromě standardních metod výzkumu stanoveny molekulárně genetické parametry. Standardní metody vyšetřování se budou opakovat po roce (2 body).

Příprava preparátů DNA. Extrakce DNA z krve byla provedena fenol-chloroformovou extrakcí. Pět až šest objemů pufru A (10 mM Tris-HCl, pH=7,5; 10 mM NaCl; 3 mM MgCl2) bylo přidáno k 1 objemu vzorku krve a sraženiny byly rozetřeny v homogenizátoru. Po centrifugaci při 2500 g po dobu 15 minut byly sraženiny třikrát promyty pufrem A a resuspendovány v 1 ml pufru B (10 mM EDTA; 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5). Po přidání SDS do 0,5 % a proteinázy E na 200 ug/ml byla směs inkubována 12 hodin při 56 °C. Deproteinizace byla provedena postupně směsí fenol-chloroform (1:1), vodou nasyceným fenolem, směsí fenol-chloroform (1:1) a chloroformem. DNA byla precipitována přidáním roztoku NaCl k 1 M a 1 V isopropylalkoholu. Poté se roztok chladil po dobu 1 hodiny při -20 °C. Sraženina získaná odstředěním na Eppendorfově mikrocentrifuze při 12 000 g po dobu 15 minut byla třikrát promyta 75% ethanolem a následně odstředěna po dobu 5 minut. 12000g a po vysušení při 56 °C rozpuštěné v deinanilizované vodě na koncentraci DNA 0,5 µg/μl. Genotypizace polymorfismů byla provedena pomocí real-time PCR podle protokolu výrobce (TaqMan probes, Thermo Fisher Scientific, USA) dne nástroj StepOnePlus. Byly vybrány podle výsledků mezinárodních celogenomových asociačních studií (GWAS), které potvrdily asociaci těchto SNP s koronárním srdečním onemocněním (CHD), zánětlivým procesem, který hraje významnou roli v progresi aterosklerózy.

Metody statistické analýzy. Pro statistickou analýzu molekulárně-genetických dat bude použit softwarový balík SPSS 22.0. První etapou bude stanovení četností genotypů a alel studovaných SNP u skupiny pacientů po infarktu myokardu se zvýšenými hodnotami kardiospecifických markerů a srovnávací skupiny, kde budou kardiospecifické markery v mezích normy; poté posoudíme shodu četností genotypů s Hardy-Weinbergovou rovnováhou v kontrolní skupině (pomocí kritéria chí-kvadrát). Dojde k porovnání úrovní ukazatelů jako je věk; hladina kreatininu; diagnostická úroveň biomarkerů myokardiální nekrózy: MB kreatinkináza a troponin, protein vázající mastné kyseliny (FABP); index tělesné hmotnosti; obvod pasu; koncentrace C-peptidu v séru; hladiny glykémie při přijetí a propuštění; hladiny hemoglobinu v krvi při přijetí a propuštění; Systolický a diastolický krevní tlak při přijetí; srdeční frekvence při přijetí; hodnota ejekční frakce levé komory pomocí echokardiografie; koncentrace HCMP v séru; lipidogram: sérová koncentrace lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL), lipoproteinů s vysokou hustotou (HDL), celkový cholesterol, triglyceridy; výška, hmotnost, index tělesné hmotnosti, u nositelů různých genotypů byly provedeny po kontrole normality distribuce těchto znaků pomocí Kolmogorov-Smirnovova testu. Pokud by znaky splňovaly kritéria normálního rozdělení, byla by použita jednofaktorová analýza rozptylu. Významnost rozdílů mezi dvěma genotypovými třídami bude navíc kontrolována pomocí t-testu pro dva nezávislé vzorky. Pokud sledovaný znak nesplňuje kritéria normální distribuce, bude provedeno srovnání úrovně tohoto znaku u nositelů různých genotypů pomocí Kruskal-Wallisova testu; spolehlivost rozdílů mezi dvěma genotypovými třídami bude navíc kontrolována pomocí Mann-Whitneyho testu pro dva nezávislé vzorky. Asociace SNP s rizikovými faktory souvisejícími s kategorickými proměnnými bude testována pomocí konjugačních tabulek pomocí Pearsonova chí-kvadrát testu. V případě čtyřpolních tabulek bude srovnání vzorků podle genotypu a četnosti alel používat Fisherovo přesné oboustranné kritérium. Relativní riziko (OR - poměr šancí) výsledku onemocnění/přítomnosti rizikového faktoru pro konkrétní alelu nebo genotyp se vypočte jako poměr šancí.

Vliv klinických, demografických, funkčních, metabolických, zánětlivých parametrů a markerů nekrózy myokardu na dlouhodobou prognózu bude hodnocen pomocí poměru šancí (0,95 interval spolehlivosti).