Riesgo personalizado de aterosclerosis rápidamente progresiva (RPA)

Diseño del estudio: estudio abierto, continuo, retrospectivo y prospectivo mediante el método de grupos paralelos.

En el trabajo de tesis se definieron tres puntos de control: el primer punto fue retrospectivo, 2 años antes del estudio; el segundo fue el día de inclusión en el estudio; y el tercero fue 12 meses después de la inclusión.

El punto retrospectivo abarcó 2 años a partir de la fecha de inclusión del paciente en el estudio (período de enero de 2019 a enero de 2021) con determinación de un amplio espectro de parámetros de carácter clínico, instrumental, de laboratorio que potencialmente influyen en la aparición y progresión de la aterosclerosis (según el análisis de la literatura). Los exámenes mencionados fueron realizados y evaluados en dos momentos: el primero - en el momento del primer evento coronario precedente durante el período retrospectivo de dos años, el segundo - en el momento de la inclusión del paciente en el presente estudio. 202 pacientes fueron divididos en dos grupos.

Métodos de estudio. En el momento de la inclusión (1 punto) en el estudio, todos los pacientes se sometieron a un examen clínico general con evaluación de las quejas y el estado clínico, un examen de laboratorio con análisis de sangre generales y bioquímicos, incluido un examen bioquímico especial del suero sanguíneo para determinar el nivel de alta sensibilidad. Proteína C reactiva (CRP, mg/L) y espectro de lípidos, incluyendo colesterol total (GC, mmol/L), lipoproteínas de baja densidad (LDL, mmol/L), lipoproteínas de alta densidad (HDL, mmol/L), triglicéridos (TG, mmol/L); análisis de orina y exámenes instrumentales: electrocardiografía (ECG), ecocardiografía (Echo-CG), R-grafía de órganos del tórax, angiografía coronaria selectiva Además de los métodos de investigación estándar, a todos los pacientes se les determinarán los parámetros genéticos moleculares. Los métodos estándar de investigación se repetirán después de un año (2 puntos).

Preparación de preparaciones de ADN. La extracción de ADN de la sangre se realizó mediante extracción con fenol-cloroformo. Se añadieron de cinco a seis volúmenes de tampón A (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5; NaCl 10 mM; MgCl2 3 mM) a 1 volumen de muestra de sangre y los coágulos se frotaron en un homogeneizador. Después de centrifugar a 2500 g durante 15 min, los precipitados se lavaron tres veces con tampón A y se resuspendieron en 1 ml de tampón B (EDTA 10 mM; NaCl 100 mM; Tris-HCl 50 mM, pH = 8,5). Después de agregar SDS al 0,5 % y proteinasa E a 200 μg/mL, la mezcla se incubó durante 12 horas a 56 °C. La desproteinización se realizó secuencialmente con una mezcla de fenol-cloroformo (1:1), fenol saturado con agua, mezcla de fenol-cloroformo (1:1) y cloroformo. El ADN se precipitó añadiendo solución de NaCl a alcohol isopropílico 1 M y 1 V. Posteriormente, la solución se enfrió durante 1 h a -20 °C. El precipitado obtenido por centrifugación en una microcentrífuga Eppendorf a 12000 g durante 15 min se lavó tres veces con etanol al 75 % seguido de centrifugación durante 5 min. 12000g y, después de secar a 56 °C, se disolvió en agua desinanizada hasta una concentración de ADN de 0,5 µg/µl. El genotipado de polimorfismos se realizó mediante PCR en tiempo real según el protocolo del fabricante (sondas TaqMan, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) en un instrumento StepOnePlus. Fueron seleccionados de acuerdo con los resultados de los estudios internacionales de asociación del genoma completo (GWAS), que confirmaron la asociación de estos SNP con la enfermedad cardíaca coronaria (CHD), un proceso inflamatorio que juega un papel importante en la progresión de la aterosclerosis.

Métodos de análisis estadístico. El paquete de software SPSS 22.0 se utilizará para el análisis estadístico de datos de genética molecular. La primera etapa será determinar las frecuencias de genotipos y alelos de los SNP estudiados en el grupo de pacientes con infarto de miocardio con valores elevados de marcadores cardioespecíficos y el grupo de comparación, donde los marcadores cardioespecíficos estarán dentro de los límites normales; luego evaluaremos el cumplimiento de las frecuencias genotípicas con el equilibrio de Hardy-Weinberg en el grupo de control (utilizando el criterio de chi-cuadrado). Habrá una comparación de los niveles de indicadores como la edad; nivel de creatinina; nivel diagnóstico de biomarcadores de necrosis miocárdica: MB creatina quinasa y troponina, proteína fijadora de ácidos grasos (FABP); índice de masa corporal; circunferencia de la cintura; concentración sérica de péptido C; niveles de glucemia al ingreso y al alta; niveles de hemoglobina en sangre al ingreso y al alta; Presión arterial sistólica y diastólica al ingreso; frecuencia cardíaca al ingreso; valor de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo por ecocardiografía; concentración sérica de HCMP; lipidograma: concentración sérica de lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteínas de alta densidad (HDL), colesterol total, triglicéridos; la altura, el peso, el índice de masa corporal, en portadores de diferentes genotipos se realizaron después de verificar la normalidad de la distribución de estas características mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Si los rasgos cumplieran los criterios de distribución normal, se usaría un análisis de varianza de un solo factor. La importancia de las diferencias entre dos clases genotípicas se verificará adicionalmente mediante la prueba t para dos muestras independientes. Si una característica en estudio no cumple con los criterios de distribución normal, la comparación del nivel de esta característica en portadores de diferentes genotipos se realizará mediante la prueba de Kruskal-Wallis; la fiabilidad de las diferencias entre las dos clases genotípicas se comprobará adicionalmente mediante la prueba de Mann-Whitney para dos muestras independientes. La asociación de SNP con factores de riesgo relacionados con variables categóricas se probará con tablas de conjugación utilizando la prueba de chi-cuadrado de Pearson. En el caso de tablas de cuatro campos, la comparación de muestras por genotipo y frecuencias alélicas utilizará el criterio bilateral exacto de Fisher. El riesgo relativo (OR - razón de probabilidades) de resultado de la enfermedad/presencia de factores de riesgo para un alelo o genotipo en particular se calculará como razón de probabilidades.

La influencia de los parámetros clínicos, demográficos, funcionales, metabólicos, inflamatorios y los marcadores de necrosis miocárdica en el pronóstico a largo plazo se evaluará mediante la razón de posibilidades (intervalo de confianza de 0,95).