LMP-spesifiset T-solut potilaille, joilla on uusiutunut EBV-positiivinen lymfooma (ALCI)

ALASCER (osa 1/2)

Luomme autologisia (tai syngeenisiä) tai allogeenisiä LMP2A-spesifisiä sytotoksisia T-soluja ja siirrämme ne potilaille, joilla on uusiutunut EBV-positiivinen Hodgkinin tai non-Hodgkinin lymfooma tai lymfoepiteliooma.

LMP-spesifisen CTL-linjan aloittamiseksi PBMC transdusoidaan adenovirusvektorilla (Ad5f35-pp65), joka ekspressoi LMP2-antigeeniä viruspartikkelin (vp) ja solun suhteen ollessa 30 000:1. Normaalien luovuttajien verinäytteitä varten PBMC:n monosyyttifraktio voidaan transdusoida ja se ilmentää ja esittelee LMP2-peptidiepitooppeja PBMC:n LMP2-spesifiselle T-solufraktiolle. Tämä vaihe vaatii 20-40 x 106 PBMC:tä noin 40 ml:sta verta.

Kun tarvitaan vahvempaa ärsykettä LMP2-spesifisten T-soluprekursorien aktivoimiseksi uudelleen (eli potilaiden PBMC:stä), teemme dendriittisolujen APC:itä viljelemällä PBMC-peräisiä monosyyttejä sytokiinien (GM-CSF, IL-4) kanssa, mitä seuraa transduktio Ad5f35-LMP2 (vp:solusuhde 30000:1) ja kypsyminen TNF-a:lla ja PGE1:llä. Näitä kypsiä, transdusoituja dendriittisoluja käytetään stimuloimaan PBMC-peräisiä T-soluja. Tässä tapauksessa dendriittisoluja valmistetaan noin 40 ml:sta verta ja T-solut saadaan 20-40 ml:sta verta.

LMP2-spesifisten T-solujen laajentamiseksi käytämme EBV-transformoituja B-lymfoblastoidisolulinjoja (EBV-LCL), jotka on transdusoitu Ad5f35-LMP2:lla (vp:LCL-suhde 100 000:1). Tämä transduktio sallii EBV-LCL:ien esitellä LMP2-peptidejä T-soluille. EBV-LCL:t ovat peräisin PBMC-B-lymfosyyteistä infektoimalla kliinisen Epstein-Barr-viruksen (EBV) laboratoriokannan kanssa. EBV-LCL:n muodostamiseen tarvitaan noin 5 x 106 PBMC tai 5-10 ml verta

CTL-viljelyjakson lopussa LMP2-spesifisten CTL:ien esiintymistiheys määritetään käyttämällä tetrameerireagensseja, jos niitä on saatavilla.

Transduktio neomysiiniresistenssigeenillä (valinnainen - potilaan mieltymysten ja vektorin saatavuuden perusteella). Vakiintuneet CTL:t transdusoidaan LN-sarjan retrovirusvektoreilla.

Potilaat arvioidaan klinikalla ja 2-4 annosta CTL:ää annetaan kahden viikon välein. Potilaita seurataan kliinisen toksisuuden varalta NCI Common Toxicity Criteria Scale -asteikolla (versio 2.0 osoitteessa http://ctep.cancer.gov). Lisäksi määritämme CTL-eloonjäämisen kinetiikkaa seuraamalla markkerigeenin läsnäoloa ääreisveressä potilailla, jotka saavat merkittyjä soluja. Analysoimme myös immunologisia parametreja, mukaan lukien fenotyyppi- ja CTL-taajuudet, tetrameeritutkimuksilla potilailla, joilla on HLA-tyyppejä, jos tällaisia ​​reagensseja on saatavilla. Toiminnalliset analyysit tehdään sytotoksisuus- tai ELISPOT/ELISA-määrityksillä. Verrataan EBV DNA:n tasoja ääreisveressä ennen infuusiota ja sen jälkeen. 8 viikon ajanjakso on kliinisen turvallisuuden seurannan aika. Jos potilailla on ollut osittainen vaste tai heillä on stabiili sairaus, he ovat oikeutettuja saamaan enintään 6 lisäannosta CTL:iä, joista jokainen koostuu samasta määrästä kuin heidän toinen injektionsa.

ALCI (osa 2/2)

Tämä on ALASCER-tutkimuksen toinen osa. ALCI heijasti muutosta valmistusprosessissa CTL-tuotteen rikastamiseksi soluille, jotka tunnistavat LMP1:n sekä LMP2-antigeenin. Sekä LMP2a:n että LMP1:n rikastamiseen vaadittava valmistusmuutos on ainoastaan ​​ALCI:n Ad5f35LMP1/2-vektorin korvaaminen aiemmin käytetyllä Ad5f35LMP2-vektorilla, jota käytettiin transdusoimaan antigeeniä esitteleviä soluja, joita käytettiin ex vivo stimuloimaan T-soluja valmistusprosessin aikana GMP-laboratorioissamme. .

Käytimme alun perin AD5f35LMP2-vektoria ja nyt Ad5f35LMP1/2-vektoria LMP-spesifisen CTL:n luomiseen. Alustavat tietomme osoittavat, että nämä kaksi vektoria ovat identtisiä ja tuottavat samanlaisen LMP2-spesifisen CTL:n rikastumisen. Käyttämällä Ad5f35LMP1/2-vektoria pelkän LMP2:ta koodaavan Ad5f35-vektorin sijasta meidän pitäisi paremmin rikastaa T-soluklooneja, jotka tunnistavat sekä Hodgkinin taudin että non-Hodgkinin lymfooman pahanlaatuisten solujen ekspressoimat LMP-antigeenit. Analyysistrategiamme sisältävät suunnitelmia tehdä vertailuja näiden vektorityyppien välillä.

Kuten ALASCER-tuote, ALCI-tuote oli edelleen CTL-linja, joka oli spesifinen EBV-antigeeneille, mutta rikastettu LMP1:n ja LMP2:n tunnistaville T-soluille. ALASCER-tuote sisältää jo joitakin LMP1-spesifisiä T-soluja sekä T-soluja, jotka ovat spesifisiä muille EBV-antigeeneille, ja ainoa muutos oli näiden solujen rikastaminen. Siksi ALCI Ad5f35 LMP1/2 -adenovirusvektori on apureagenssi valmistusprosessissa, jota käytetään vain stimulaattorisoluina käytettyjen antigeeniä esittelevien solujen transdusoimiseen, eikä sitä infusoita lopputuotteeseen. Tämä vektori suoritti testauksen ja se hyväksyttiin käytettäväksi ALASCER IND:n (#6387) alla.

Lisäksi ALASCER-protokollan suunnittelua muutettiin, jotta tutkimukseen voidaan lisätä erillinen haara valmistusprosessissa käytetyn vektorin mukaan ja tiedot analysoidaan erikseen.

Sekä ALASCER:ssä että ALCI:ssa solut sulatetaan ja ruiskutetaan potilaaseen 10 minuutin aikana. Aluksi annetaan kaksi annosta T-soluja kahden viikon välein. Jos toisen infuusion jälkeen lymfooman koko pienenee TT- tai MRI-kuvauksessa radiologin arvioimalla, potilas voi saada halutessaan jopa kuusi lisäannosta T-soluja. Tämä on annoksen korotustutkimus, mikä tarkoittaa, että joillekin potilaille toinen annos voi olla suurempi kuin ensimmäinen. Kaikki hoidot antaa Texasin lastensairaalan solu- ja geeniterapiakeskus tai metodistisairaala.

Potilasta seurataan injektioiden jälkeen. Heidät joko nähdään klinikalla tai tutkimussairaanhoitaja ottaa heihin yhteyttä vuosittain 5 vuoden ajan. Saadaksesi lisätietoja tavasta, jolla T-solut toimivat potilaan kehossa, otetaan ylimääräinen 20–40 ml (4–8 teelusikallista) verta ennen jokaista infuusiota ja sitten 4 tuntia jokaisen infuusion jälkeen (valinnainen) ja 3–3 4 päivää jokaisen infuusion jälkeen (valinnainen) ja sitten viikoittain 2 viikon ajan jokaisen infuusion jälkeen (yhteensä 9 kertaa). Kaksi viikkoa viimeisen infuusion jälkeen verta otetaan sitten uudelleen ja sen jälkeen 3 kuukauden välein 1 vuoden ajan, sitten kerran vuodessa 5 vuoden ajan. Tutkijat käyttävät tätä verta nähdäkseen, kuinka kauan T-solut kestävät, ja tarkastellakseen immuunivastetta potilaan syöpään.

ALCI (laajennuskohortti)

Kun tutkimuksen annoksen nostamisen turvallisuusvaihe on saatu päätökseen (ts. kun vähintään 3 potilasta on hoidettu annostasolla 3 eikä hoitoon liittyvää DLT:tä ole esiintynyt), aiomme hoitaa lisää potilaita annostasolla 1 arvioidaksemme immunologista vastetta potilailla, jotka saavat CTL-soluja, jotka on tuotettu käyttämällä DC:tä, joka on kypsytetty lisäkypsymissytokiinit (IL-1b ja IL-6) IL-15:n läsnä ollessa. Hoidamme lisäksi 30, 16 ja 16 potilasta ryhmissä A, B ja C.