Komórki T specyficzne dla LMP dla pacjentów z nawracającym chłoniakiem EBV-dodatnim (ALCI)

ALASCER (Część 1 z 2)

Wygenerujemy autologiczne (lub syngeniczne) lub allogeniczne limfocyty T cytotoksyczne swoiste dla LMP2A i w sposób adopcyjny przekażemy je pacjentom z nawrotowym chłoniakiem Hodgkina lub nieziarniczym z dodatnim wynikiem EBV lub chłoniakiem nabłonka.

Aby zainicjować linię CTL specyficzną dla LMP, PBMC transdukuje się wektorem adenowirusowym (Ad5f35-pp65) wykazującym ekspresję antygenu LMP2, przy stosunku cząstek wirusowych (vp) do komórek wynoszącym 30 000:1. W przypadku próbek krwi od normalnych dawców frakcja monocytów PBMC może być transdukowana i będzie eksprymować i prezentować epitopy peptydowe LMP2 specyficznej dla LMP2 frakcji komórek T PBMC. Ten krok będzie wymagał od 20 do 40 x 106 PBMC z około 40 ml krwi.

Gdy wymagany jest silniejszy bodziec do reaktywacji prekursorów limfocytów T specyficznych dla LMP2 (tj. od pacjentów PBMC), wówczas APC z komórek dendrytycznych wytworzymy poprzez hodowlę monocytów pochodzących z PBMC z cytokinami (GM-CSF, IL-4), a następnie transdukcję z Ad5f35-LMP2 (stosunek vp:komórki 30000:1) i dojrzewanie z TNF-a i PGE1. Te dojrzałe, transdukowane komórki dendrytyczne zostaną użyte do stymulacji komórek T pochodzących z PBMC. W tym przypadku komórki dendrytyczne zostaną przygotowane z około 40 ml krwi, a limfocyty T z 20 do 40 ml krwi

W celu namnażania limfocytów T specyficznych dla LMP2 użyjemy linii limfoblastoidalnych komórek B transformowanych EBV (EBV-LCL) transdukowanych Ad5f35-LMP2 (stosunek vp:LCL 100 000:1). Ta transdukcja umożliwia komórkom T EBV-LCL prezentację peptydów LMP2. EBV-LCL są uzyskiwane z limfocytów PBMC-B przez zakażenie szczepem laboratoryjnym wirusa Epsteina-Barra (EBV) o stopniu czystości klinicznej. Do wygenerowania EBV-LCL potrzeba około 5 x 106 PBMC lub 5 do 10 ml krwi

Pod koniec okresu hodowli CTL, częstotliwość występowania CTL specyficznych dla LMP2 zostanie określona przy użyciu odczynników tetramerowych, jeśli są dostępne.

Transdukcja z genem oporności na neomycynę (opcjonalnie – na podstawie preferencji pacjenta i dostępności wektora). Ustalone CTL będą transdukowane wektorami retrowirusowymi serii LN.

Pacjenci będą oceniani w klinice i będą podawane 2-4 dawki CTL w odstępach dwutygodniowych. Pacjenci będą monitorowani pod kątem toksyczności klinicznej za pomocą skali NCI Common Toxicity Criteria Scale (wersja 2.0, dostępna pod adresem http://ctep.cancer.gov). Ponadto określimy kinetykę przeżycia CTL poprzez monitorowanie obecności genu markerowego we krwi obwodowej u pacjentów, którzy otrzymują znakowane komórki. Przeanalizujemy również parametry immunologiczne, w tym fenotyp i częstości CTL, w badaniach tetramerowych u pacjentów z typami HLA, o ile takie odczynniki są dostępne. Analizy funkcjonalne zostaną wykonane za pomocą testów cytotoksyczności lub ELISPOT/ELISA. Porównane zostaną poziomy DNA wirusa EBV we krwi obwodowej przed i po infuzji. Okres 8 tygodni będzie stanowił czas monitorowania bezpieczeństwa klinicznego. Jeśli pacjenci uzyskali częściową odpowiedź lub stabilizację choroby, będą kwalifikować się do otrzymania do 6 kolejnych dawek CTL, z których każda będzie zawierać taką samą liczbę jak ich drugie wstrzyknięcie.

ALCI (część 2 z 2)

Jest to druga część badania ALASCER. ALCI odzwierciedlał modyfikację procesu produkcyjnego w celu wzbogacenia produktu CTL w komórki rozpoznające antygen LMP1 i LMP2. Zmiana w produkcji wymagana do wzbogacenia zarówno w LMP2a, jak i LMP1 polega wyłącznie na zastąpieniu wektora Ad5f35LMP1/2 firmy ALCI wcześniej używanym wektorem Ad5f35LMP2 używanym do transdukcji komórek prezentujących antygen, stosowanych ex vivo do stymulacji komórek T podczas procesu produkcyjnego w naszych laboratoriach GMP .

Początkowo używaliśmy wektora AD5f35LMP2, a teraz używamy wektora Ad5f35LMP1/2 do wygenerowania CTL specyficznego dla LMP. Nasze wstępne dane wskazują, że te dwa wektory są identyczne i powodują podobne wzbogacenie CTL specyficznych dla LMP2. Używając wektora Ad5f35LMP1/2 zamiast wektora Ad5f35 kodującego sam LMP2, powinniśmy lepiej wzbogacić klony komórek T rozpoznające oba antygeny LMP eksprymowane przez komórki nowotworowe w chorobie Hodgkina i chłoniaku nieziarniczym. Nasze strategie analizy obejmują plany przeprowadzenia porównań między tymi typami wektorów.

Podobnie jak produkt ALASCER, produkt ALCI nadal był linią CTL specyficzną dla antygenów EBV, ale wzbogaconą o limfocyty T rozpoznające zarówno LMP1, jak i LMP2. Produkt ALASCER zawiera już pewne komórki T specyficzne dla LMP1 wraz z komórkami T specyficznymi dla innych antygenów EBV, a jedyną zmianą było wzbogacenie tych komórek. W związku z tym wektor adenowirusowy ALCI Ad5f35 LMP1/2 jest odczynnikiem pomocniczym w procesie produkcyjnym, używanym wyłącznie do transdukcji komórek prezentujących antygen wykorzystywanych jako komórki stymulatorowe i nie jest wprowadzany do produktu końcowego. Ten wektor przeszedł testy i został zatwierdzony do użytku w ramach ALASCER IND (nr 6387).

Dodatkowo zmieniono projekt protokołu ALASCER, aby umożliwić dodanie oddzielnego ramienia do badania w zależności od wektora użytego w procesie produkcyjnym, a dane są analizowane oddzielnie

Zarówno w ALASCER, jak i ALCI, komórki będą następnie rozmrażane i wstrzykiwane pacjentowi przez 10 minut. Początkowo zostaną podane dwie dawki limfocytów T w odstępie dwóch tygodni. Jeśli po drugim wlewie w ocenie radiologa chłoniak stwierdzi zmniejszenie rozmiaru chłoniaka w tomografii komputerowej lub rezonansie magnetycznym, pacjent może otrzymać do sześciu dodatkowych dawek limfocytów T, jeśli sobie tego życzy. Jest to badanie polegające na zwiększaniu dawki, co oznacza, że ​​u niektórych pacjentów druga dawka może być większa niż pierwsza. Wszystkie zabiegi będą wykonywane przez Centrum Terapii Komórkowej i Genowej w Szpitalu Dziecięcym w Teksasie lub Szpitalu Metodystów.

Pacjent będzie obserwowany po wstrzyknięciach. Będą oni albo widziani w klinice, albo będą kontaktować się z pielęgniarką badawczą co roku przez 5 lat. Aby dowiedzieć się więcej o działaniu limfocytów T w organizmie pacjenta, przed każdym wlewem, a następnie 4 godziny po każdym wlewie (opcjonalnie) zostanie pobrane dodatkowe 20-40 ml (4-8 łyżeczek) krwi i 3- 4 dni po każdym wlewie (opcjonalnie), a następnie co tydzień przez 2 tygodnie po każdym wlewie (łącznie 9 razy). Dwa tygodnie po ostatniej infuzji krew zostanie ponownie pobrana, a następnie co 3 miesiące przez 1 rok, a następnie raz w roku przez 5 lat. Badacze wykorzystają tę krew, aby zobaczyć, jak długo żyją limfocyty T i przyjrzeć się odpowiedzi immunologicznej na raka pacjenta.

ALCI (kohorta rozszerzona)

Po zakończeniu fazy badania dotyczącej bezpieczeństwa zwiększania dawki (tj. gdy co najmniej 3 pacjentów było leczonych dawką na poziomie 3 i nie wystąpiła DLT związana z leczeniem), planujemy leczyć dodatkowych pacjentów dawką na poziomie 1 w celu oceny odpowiedzi immunologicznej u pacjentów, którzy otrzymali CTL, które zostały wygenerowane przy użyciu dojrzewających DC dodatkowe cytokiny dojrzewania (IL-1b i IL-6) w obecności IL-15. Będziemy leczyć dodatkowych 30, 16 i 16 pacjentów odpowiednio w grupach A, B i C.