LMP-spezifische T-Zellen für Patienten mit rezidiviertem EBV-positivem Lymphom (ALCI)

ALASCER (Teil 1 von 2)

Wir werden autologe (oder syngene) oder allogene LMP2A-spezifische zytotoxische T-Zellen erzeugen und sie adoptiv auf Patienten mit rezidiviertem EBV-positivem Hodgkin- oder Non-Hodgkin-Lymphom oder Lymphoepitheliom übertragen.

Um die LMP-spezifische CTL-Linie zu initiieren, werden PBMC mit einem Adenovirus-Vektor (Ad5f35-pp65), der das LMP2-Antigen exprimiert, in einem Verhältnis von viralen Partikeln (vp) zu Zellen von 30.000:1 transduziert. Bei Blutproben von normalen Spendern kann die Monozytenfraktion von PBMC transduziert werden und wird LMP2-Peptid-Epitope exprimieren und der LMP2-spezifischen T-Zellfraktion der PBMC präsentieren. Dieser Schritt erfordert 20 bis 40 x 106 PBMC aus etwa 40 ml Blut.

Wenn ein stärkerer Stimulus erforderlich ist, um LMP2-spezifische T-Zell-Vorläufer zu reaktivieren (d. h. von Patienten PBMC), dann werden wir dendritische Zell-APCs durch Kultur von PBMC-abgeleiteten Monozyten mit Zytokinen (GM-CSF, IL-4) herstellen, gefolgt von Transduktion mit Ad5f35-LMP2 (vp:Zellverhältnis von 30000:1) und Reifung mit TNF-a und PGE1. Diese reifen, transduzierten dendritischen Zellen werden verwendet, um PBMC-abgeleitete T-Zellen zu stimulieren. In diesem Fall werden dendritische Zellen aus etwa 40 ml Blut und die T-Zellen aus 20 bis 40 ml Blut gewonnen

Um die LMP2-spezifischen T-Zellen zu erweitern, werden wir EBV-transformierte B-Lymphoblastoid-Zelllinien (EBV-LCLs) verwenden, die mit Ad5f35-LMP2 (vp:LCL-Verhältnis von 100.000:1) transduziert wurden. Diese Transduktion ermöglicht es den EBV-LCLs, den T-Zellen LMP2-Peptide zu präsentieren. EBV-LCLs werden von PBMC-B-Lymphozyten durch Infektion mit einem klinisch reinen Laborstamm des Epstein-Barr-Virus (EBV) gewonnen. Etwa 5 x 106 PBMC oder 5 bis 10 ml Blut sind erforderlich, um das EBV-LCL zu erzeugen

Am Ende der CTL-Kulturperiode wird die Häufigkeit von LMP2-spezifischen CTL unter Verwendung von Tetramer-Reagenzien, sofern verfügbar, bestimmt.

Transduktion mit dem Neomycin-Resistenzgen (optional – je nach Patientenpräferenz und Verfügbarkeit des Vektors). Etablierte CTLs werden mit den retroviralen Vektoren der LN-Reihe transduziert.

Die Patienten werden in der Klinik untersucht und im Abstand von zwei Wochen werden 2-4 CTL-Dosen verabreicht. Die Patienten werden anhand der NCI Common Toxicity Criteria Scale (Version 2.0 unter http://ctep.cancer.gov) auf klinische Toxizität überwacht. Darüber hinaus werden wir die Kinetik des CTL-Überlebens bestimmen, indem wir das Vorhandensein des Markergens im peripheren Blut von Patienten überwachen, die markierte Zellen erhalten. Wir werden auch immunologische Parameter einschließlich Phänotyp und CTL-Frequenzen durch Tetramer-Studien bei Patienten mit HLA-Typen analysieren, bei denen solche Reagenzien verfügbar sind. Funktionelle Analysen werden durch Zytotoxizitäts- oder ELISPOT/ELISA-Assays durchgeführt. Die EBV-DNA-Spiegel im peripheren Blut vor und nach der Infusion werden verglichen. Ein Zeitraum von 8 Wochen stellt die Zeit für die Überwachung der klinischen Sicherheit dar. Wenn Patienten ein partielles Ansprechen hatten oder eine stabile Krankheit haben, können sie bis zu 6 weitere CTL-Dosen erhalten, von denen jede aus der gleichen Anzahl besteht wie ihre zweite Injektion.

ALCI (Teil 2 von 2)

Dies ist der 2. Teil der ALASCER-Studie. ALCI spiegelte eine Modifikation des Herstellungsverfahrens wider, um das CTL-Produkt für Zellen anzureichern, die sowohl das LMP1- als auch das LMP2-Antigen erkennen. Die zur Anreicherung sowohl für LMP2a als auch für LMP1 erforderliche Änderung der Herstellung besteht ausschließlich darin, den Ad5f35LMP1/2-Vektor von ALCI durch den zuvor verwendeten Ad5f35LMP2-Vektor zu ersetzen, der zur Transduktion der Antigen-präsentierenden Zellen verwendet wird, die ex vivo verwendet werden, um die T-Zellen während des Herstellungsprozesses in unseren GMP-Labors zu stimulieren .

Wir haben anfänglich den AD5f35LMP2-Vektor verwendet und verwenden jetzt den Ad5f35LMP1/2-Vektor, um LMP-spezifische CTL zu erzeugen. Unsere vorläufigen Daten zeigen, dass diese beiden Vektoren identisch sind und eine ähnliche Anreicherung von LMP2-spezifischen CTL erzeugen. Durch die Verwendung des Ad5f35LMP1/2-Vektors anstelle des Ad5f35-Vektors, der nur für LMP2 kodiert, sollten wir T-Zellklone besser anreichern, die beide LMP-Antigene erkennen, die von den malignen Zellen bei der Hodgkin-Krankheit und dem Non-Hodgkin-Lymphom exprimiert werden. Unsere Analysestrategien beinhalten Pläne zur Durchführung von Vergleichen zwischen diesen Vektortypen.

Wie das ALASCER-Produkt war das ALCI-Produkt weiterhin eine CTL-Linie, die spezifisch für EBV-Antigene war, aber angereichert war für T-Zellen, die sowohl LMP1 als auch LMP2 erkennen. Das ALASCER-Produkt enthält bereits einige LMP1-spezifische T-Zellen zusammen mit T-Zellen, die für andere EBV-Antigene spezifisch sind, und die einzige Änderung war die Anreicherung dieser Zellen. Daher ist der adenovirale Vektor ALCI Ad5f35 LMP1/2 ein Hilfsreagenz im Herstellungsprozess, das nur zur Transduktion von Antigen-präsentierenden Zellen verwendet wird, die als Stimulatorzellen verwendet werden, und wird nicht in das Endprodukt infundiert. Dieser Vektor hat die Tests abgeschlossen und wurde für die Verwendung unter ALASCER IND (#6387) zugelassen.

Darüber hinaus wurde das Design des ALASCER-Protokolls geändert, um je nach dem für den Herstellungsprozess verwendeten Vektor die Hinzufügung eines separaten Arms zur Studie zu ermöglichen, und die Daten werden separat analysiert

Sowohl bei ALASCER als auch bei ALCI werden die Zellen dann aufgetaut und dem Patienten über 10 Minuten injiziert. Zunächst werden zwei Dosen T-Zellen im Abstand von zwei Wochen verabreicht. Wenn nach der zweiten Infusion eine Verringerung der Größe des Lymphoms im CT- oder MRT-Scan auftritt, wie von einem Radiologen beurteilt, kann der Patient bis zu sechs zusätzliche Dosen der T-Zellen erhalten, wenn der Patient dies wünscht. Dies ist eine Dosiseskalationsstudie, was bedeutet, dass bei einigen Patienten die zweite Dosis größer sein kann als die erste. Alle Behandlungen werden vom Zentrum für Zell- und Gentherapie des Texas Children's Hospital oder des Methodist Hospital durchgeführt.

Der Patient wird nach den Injektionen überwacht. Sie werden entweder in der Klinik gesehen oder 5 Jahre lang jährlich von einer Forschungskrankenschwester kontaktiert. Um mehr über die Funktionsweise der T-Zellen im Körper des Patienten zu erfahren, werden vor jeder Infusion weitere 20–40 ml (4–8 Teelöffel) Blut abgenommen und dann 4 Stunden nach jeder Infusion (optional) und 3– 4 Tage nach jeder Infusion (optional) und dann wöchentlich für 2 Wochen nach jeder Infusion (insgesamt 9 Mal). Zwei Wochen nach der letzten Infusion wird dann erneut Blut abgenommen und dann 1 Jahr lang alle 3 Monate, dann 5 Jahre lang einmal jährlich. Die Ermittler werden dieses Blut verwenden, um zu sehen, wie lange die T-Zellen überleben, und um die Immunantwort auf den Krebs des Patienten zu untersuchen.

ALCI (Erweiterungskohorte)

Sobald die Sicherheitsphase der Dosiseskalation der Studie abgeschlossen ist (d. h. sobald mindestens 3 Patienten mit Dosisstufe 3 behandelt wurden und keine behandlungsbedingte DLT aufgetreten ist), planen wir, weitere Patienten mit Dosisstufe 1 zu behandeln, um die immunologische Reaktion bei Patienten zu bewerten, die CTL erhalten, die mit gereiften DC erzeugt wurden die zusätzlichen Reifungszytokine (IL-1b und IL-6) in Gegenwart von IL-15. Wir werden weitere 30, 16 und 16 Patienten der Gruppen A, B bzw. C behandeln.