LMP-специфические Т-клетки для пациентов с рецидивирующей EBV-положительной лимфомой (ALCI)

АЛАСКЕР (Часть 1 из 2)

Мы создадим аутологичные (или сингенные) или аллогенные LMP2A-специфические цитотоксические Т-клетки и адоптивно перенесем их пациентам с рецидивирующей EBV-положительной лимфомой Ходжкина или неходжкинской лимфомой или лимфоэпителиомой.

Чтобы инициировать LMP-специфическую линию CTL, PBMC трансдуцируют аденовирусным вектором (Ad5f35-pp65), экспрессирующим антиген LMP2, при соотношении вирусных частиц (vp) к клеткам 30000:1. Для образцов крови от нормальных доноров фракция моноцитов РВМС может быть трансдуцирована и будет экспрессировать и презентировать эпитопы пептида LMP2 LMP2-специфичной Т-клеточной фракции РВМС. На этом этапе потребуется от 20 до 40 х 106 РВМС примерно из 40 мл крови.

Когда для реактивации LMP2-специфических Т-клеток-предшественников (т. е. от пациентов с РВМС) требуется более сильный стимул, тогда мы будем создавать APC дендритных клеток путем культивирования моноцитов, полученных из РВМС, с цитокинами (GM-CSF, IL-4) с последующей трансдукцией с помощью Ad5f35-LMP2 (соотношение vp:клетки 30000:1) и созревание с TNF-α и PGE1. Эти зрелые трансдуцированные дендритные клетки будут использоваться для стимуляции Т-клеток, происходящих из РВМС. В этом случае дендритные клетки будут получены примерно из 40 мл крови, а Т-клетки будут получены из 20–40 мл крови.

Для размножения LMP2-специфических Т-клеток мы будем использовать EBV-трансформированные линии В-лимфобластоидных клеток (EBV-LCL), трансдуцированные Ad5f35-LMP2 (соотношение vp:LCL 100 000:1). Эта трансдукция позволяет EBV-LCL представлять пептиды LMP2 Т-клеткам. EBV-LCL получают из лимфоцитов PBMC-B путем инфицирования лабораторным штаммом вируса Эпштейна-Барр (EBV) клинического уровня. Для получения EBV-LCL требуется около 5 x 106 PBMC или от 5 до 10 мл крови.

В конце периода культивирования ЦТЛ частота специфических к LMP2 ЦТЛ будет определяться с использованием тетрамерных реагентов, если они доступны.

Трансдукция геном резистентности к неомицину (дополнительно - в зависимости от предпочтений пациента и наличия вектора). Установленные ЦТЛ будут трансдуцированы ретровирусными векторами серии LN.

Пациентов будут оценивать в клинике, и каждые две недели будут вводить 2-4 дозы ЦТЛ. Пациентов будут контролировать на предмет клинической токсичности по шкале общих критериев токсичности NCI (версия 2.0, размещенная на http://ctep.cancer.gov). Кроме того, мы будем определять кинетику выживаемости ЦТЛ, контролируя наличие маркерного гена в периферической крови у пациентов, получающих меченые клетки. Мы также проанализируем иммунологические параметры, включая частоту фенотипа и CTL, с помощью исследований тетрамеров у пациентов с HLA-типами, где такие реагенты доступны. Функциональные анализы будут проводиться с помощью анализов цитотоксичности или ELISPOT/ELISA. Уровни ДНК EBV в периферической крови до и после инфузии будут сравниваться. Период времени в 8 недель будет представлять собой время для мониторинга клинической безопасности. Если у пациентов наблюдается частичный ответ или стабильное заболевание, они могут получить до 6 дополнительных доз ЦТЛ, каждая из которых будет состоять из того же количества, что и их вторая инъекция.

ALCI (Часть 2 из 2)

Это вторая часть исследования ALASCER. ALCI отражал модификацию производственного процесса для обогащения продукта ЦТЛ клетками, распознающими антиген LMP1, а также антиген LMP2. Изменение в производстве, необходимое для обогащения как LMP2a, так и LMP1, заключается исключительно в замене вектора Ad5f35LMP1/2 ALCI на ранее использовавшийся вектор Ad5f35LMP2, используемый для трансдукции антигенпрезентирующих клеток, используемых ex vivo для стимуляции Т-клеток во время производственного процесса в наших лабораториях GMP. .

Первоначально мы использовали вектор AD5f35LMP2, а теперь используем вектор Ad5f35LMP1/2 для создания специфичных для LMP CTL. Наши предварительные данные показывают, что эти два вектора идентичны и производят одинаковое обогащение специфичных к LMP2 CTL. Используя вектор Ad5f35LMP1/2 вместо вектора Ad5f35, кодирующего только LMP2, мы должны лучше обогатить клоны Т-клеток, распознающие оба антигена LMP, экспрессируемые злокачественными клетками при болезни Ходжкина и неходжкинской лимфоме. Наши стратегии анализа включают планы по проведению сравнений между этими типами векторов.

Как и продукт ALASCER, продукт ALCI продолжал оставаться линией ЦТЛ, специфичной к антигенам EBV, но обогащенной Т-клетками, распознающими LMP1, а также LMP2. Продукт ALASCER уже содержит некоторые Т-клетки, специфичные для LMP1, наряду с Т-клетками, специфичными для других антигенов EBV, и единственным изменением было обогащение этими клетками. Таким образом, аденовирусный вектор ALCI Ad5f35 LMP1/2 является вспомогательным реагентом в производственном процессе, который используется только для трансдукции антигенпрезентирующих клеток, используемых в качестве клеток-стимуляторов, и не вводится в конечный продукт. Этот вектор прошел испытания и был одобрен для использования в соответствии с ALASCER IND (№ 6387).

Кроме того, в дизайн протокола ALASCER были внесены изменения, позволяющие добавить в исследование отдельную группу в зависимости от вектора, используемого для производственного процесса, и данные анализируются отдельно.

Как в ALASCER, так и в ALCI клетки затем размораживают и вводят пациенту в течение 10 минут. Первоначально две дозы Т-клеток будут вводиться с интервалом в две недели. Если после второй инфузии наблюдается уменьшение размера лимфомы на КТ или МРТ по оценке рентгенолога, пациент может получить до шести дополнительных доз Т-клеток, если пациент желает. Это исследование с повышением дозы, что означает, что для некоторых пациентов вторая доза может быть больше, чем первая. Все процедуры будут проводиться Центром клеточной и генной терапии Техасской детской больницы или Методистской больницы.

Пациент будет наблюдаться после инъекций. Их будут либо наблюдать в клинике, либо с ними будет связываться медсестра-исследователь ежегодно в течение 5 лет. Чтобы узнать больше о том, как Т-клетки работают в организме пациента, перед каждой инфузией будет взято дополнительно 20-40 мл (4-8 чайных ложек) крови, а затем через 4 часа после каждой инфузии (по желанию) и 3- 4 дня после каждой инфузии (по желанию), а затем еженедельно в течение 2 недель после каждой инфузии (всего 9 раз). Через две недели после последней инфузии кровь берут снова, а затем каждые 3 месяца в течение 1 года, затем один раз в год в течение 5 лет. Исследователи будут использовать эту кровь, чтобы увидеть, как долго сохраняются Т-клетки, и посмотреть на иммунный ответ на рак пациента.

ALCI (расширенная когорта)

После завершения фазы безопасности повышения дозы исследования (т. после того, как по крайней мере 3 пациента прошли лечение на уровне дозы 3 и не возникло связанного с лечением DLT), мы планируем лечить дополнительных пациентов на уровне дозы 1 для оценки иммунологического ответа у пациентов, получающих ЦТЛ, которые были получены с использованием ДК, созревших с дополнительные цитокины созревания (IL-1b и IL-6) в присутствии IL-15. Мы будем лечить дополнительно 30, 16 и 16 пациентов в группах A, B и C соответственно.