Silostatsolin endoteeliprogenitorisolujen ja kollateraalimuodostuksen vaikutus perifeerisessä okklusiivisessa valtimotaudissa (PAOD)

Active Comparator: Silostatsoli

Yksi tabletti (100 mg) kahdesti päivässä 12 viikon ajan

Lääke: Silostatsoli

Yksi tabletti (100 mg) kahdesti päivässä 12 viikon ajan

Muut nimet:

• Pletaal (tuotenimi)

Placebo Comparator: Tyhjä Placebo

Yksi tabletti kahdesti päivässä 12 viikon ajan

Lääke: Tyhjä Placebo

Yksi tabletti kahdesti päivässä 12 viikon ajan

Muut nimet:

• Plasebo
• Ohjaus

EPC-numero

Perifeerisen veren mononukleaarisolut (miljoona solua kussakin) suspendoidaan 100 µl:aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta ja inkuboidaan 30 minuuttia monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa ihmisen peridiniinin klorofylliproteiiniin konjugoitua erilaistumisantigeeni-45-klusteria, fykoerytriinin-konjugaation antigeeniä. differentiaatioantigeeni-34-vasta-aine ja anti-ihmiskinaasi-inserttidomeenireseptori (KDR) -vasta-aine, joka on konjugoitu Alexa Flour 647:n kanssa. Solut pestään ja analysoidaan FACSCalibur-virtaussytometrillä, jossa on 100 000 tapahtumaa lymfosyyttiportissa. EPC:t, jotka määritellään negatiivisiksi erilaistumisantigeeni-45-klusterin suhteen ja positiivisiksi erilaistumisantigeeni-34- ja KDR-klusterin suhteen. Perifeerisen veren mononukleaaristen solujen lukumäärän perusteella lasketaan kiertävien EPC:iden absoluuttinen lukumäärä µl:aa kohti.

EPC:iden pesäkkeiden muodostuminen

Perifeerisen veren mononukleaarisolut eristetään tiheysgradienttisentrifugoinnilla standardiprotokollien mukaisesti. Sentrifugoinnin jälkeen solut pestään, suspendoidaan uudelleen M199-elatusaineeseen, johon on lisätty 20 % (tilavuus/tilavuus) naudan sikiön seerumia, 10 ng/ml verisuonten endoteelin kasvutekijää, 2 ng/ml emäksistä fibroblastikasvutekijää, 10 ng/ml epidermaalista kasvutekijää ja 2 ng/ml insuliinin kasvutekijää, ja viljeltiin 24-kuoppaisilla levyillä, jotka oli päällystetty ihmisen fibronektiinillä 7 päivää. EPC-solut vahvistetaan asetyylipientiheyksisten lipoproteiinien ja lektiinin oton ja EPC-markkerien ilmentymisen avulla. Solut kerätään 7 päivän kuluttua, kiinnitetään ja värjätään kristalliviolettireagenssilla. Pesäkkeiden tiheydet kvantifioidaan Olympus-mikroskoopilla 100-kertaisella suurennuksella käyttämällä kuvantamismittausohjelmistoa.

EPC:iden elinkelpoisuus (proliferaatio).

250 000 solua kylvetään 96-kuoppaisen levyn kuhunkin kuoppaan ja soluihin lisätään 200 µl viljelyalustaa ja inkuboidaan 37 °C:ssa. Keskitason muutos tehdään 3 päivää myöhemmin. Seitsemäntenä päivänä levyä inkuboidaan sitten uudelleen 100 µl:n tuoreen väliaineen ja vielä 50 µl:n kanssa 2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenyyli)-2 vetytetratsolium-5-karboksanilidireagenssia. ja inkuboitiin edelleen pimeässä 37 °C:ssa 4 tuntia. Inkuboinnin jälkeen muodostunut oranssinvärinen kompleksi luetaan 450 nm:ssä käyttämällä mikrolevylukijaa, jossa on 450 nm:n vertailusuodatin.