Effet des cellules progénitrices endothéliales du cilostazol et de la formation collatérale dans la maladie artérielle occlusive périphérique (PAOD)

Comparateur actif: Cilostazol

Un comprimé (100 mg) deux fois par jour pendant 12 semaines

Médicament: Cilostazol

Un comprimé (100 mg) deux fois par jour pendant 12 semaines

Autres noms:

• Pletaal (nom de marque)

Comparateur placebo: Placebo factice

Un comprimé deux fois par jour pendant 12 semaines

Médicament: Placebo factice

Un comprimé deux fois par jour pendant 12 semaines

Autres noms:

• Placebo
• Contrôler

Numéro EPC en circulation

Les cellules mononucléaires du sang périphérique (un million de cellules chacune) sont mises en suspension dans 100 µL de solution saline tamponnée au phosphate et incubées pendant 30 min avec des anticorps monoclonaux contre l'antigène de différenciation conjugué à la protéine péridinine chlorophylle humaine-45, l'anti-humain conjugué à la phycoérythrine. anticorps anti-34 de différenciation et anticorps anti-récepteur de domaine d'insertion de kinase humaine (KDR) conjugués à Alexa Flour 647. Les cellules sont lavées et analysées sur un cytomètre en flux FACSCalibur avec 100 000 événements dans la porte des lymphocytes. EPC, qui sont définis comme négatifs pour le groupe d'antigène de différenciation-45 et positifs pour le groupe d'antigène de différenciation-34 et KDR. Sur la base du nombre de cellules mononucléaires du sang périphérique, le nombre absolu d'EPC en circulation/µL est calculé.

Formation de colonies par EPC

Les cellules mononucléaires du sang périphérique sont isolées par centrifugation en gradient de densité selon des protocoles standards. Après centrifugation, les cellules sont lavées, remises en suspension dans du milieu M199 additionné de 20 % (vol/vol) de sérum bovin fœtal, 10 ng/ml de facteur de croissance endothélial vasculaire, 2 ng/ml de facteur de croissance basique des fibroblastes, 10 ng/ml de facteur de croissance épidermique et 2 ng/ml de facteur de croissance de l'insuline, et cultivées dans des plaques à 24 puits recouvertes de fibronectine humaine pendant 7 jours. Les cellules EPC sont confirmées par l'absorption d'acétyl-lipoprotéine de basse densité et de lectine et par l'expression de marqueurs EPC. Les cellules sont récoltées après 7 jours, fixées et colorées avec le réactif cristal violet. Les densités de colonies sont quantifiées avec un microscope Olympus à un grossissement de 100 fois à l'aide d'un logiciel de mesure d'imagerie.

Viabilité (prolifération) des EPC

250 000 cellules sont ensemencées dans chaque puits d'une plaque 96 puits et les cellules sont additionnées de 200 µl du milieu de culture et incubées à 37°C. Le changement de milieu est effectué 3 jours plus tard. Le 7ème jour, la plaque est ensuite réincubée avec 100 μl de milieu frais et 50 μl supplémentaires de réactif 2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2 Hydrogen-Tetrazolium-5-Carboxanilide , puis incubé dans l'obscurité à 37°C pendant 4 h. Après incubation, le complexe coloré en orange formé est lu à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques avec un filtre de référence à 450 nm.