Cilostazol 내피전구세포와 말초폐쇄동맥질환(PAOD)에서 측부 형성에 미치는 영향

활성 비교기: 실로스타졸

12주 동안 1일 2회 1정(100mg)

의약품: 실로스타졸

12주 동안 1일 2회 1정(100mg)

다른 이름들:

• 플레탈(상품명)

위약 비교기: 더미 위약

12주 동안 1일 2회 1정

의약품: 더미 위약

12주 동안 1일 2회 1정

다른 이름들:

• 위약
• 제어

순환 EPC 번호

말초 혈액 단핵 세포(각각 백만 개의 세포)를 100µL 인산염 완충 식염수에 현탁하고 분화 항원-45의 인간 페리디닌 엽록소 단백질 결합 클러스터, 피코에리트린 결합 항인간 클러스터에 대한 단일 클론 항체와 함께 30분 동안 배양 Alexa Flour 647과 접합된 분화 항원-34 항체 및 항-인간 키나제 삽입 도메인 수용체(KDR) 항체. 세포를 세척하고 림프구 게이트에서 100,000개의 이벤트로 FACSCalibur 유세포 분석기에서 분석합니다. EPC는 분화 항원-45 클러스터에 대해 음성이고 분화 항원-34 및 KDR 클러스터에 대해 양성으로 정의됩니다. 말초 혈액 단핵 세포 수를 기준으로 순환 EPCs/µL의 절대 수가 계산됩니다.

EPC에 의한 콜로니 형성

말초 혈액 단핵 세포는 표준 프로토콜에 따라 밀도 구배 원심 분리에 의해 분리됩니다. 원심분리 후, 세포를 세척하고, 20%(vol/vol) 태아 소 혈청, 10ng/ml 혈관 내피 성장 인자, 2ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자, 10ng/ml 표피 성장 인자가 보충된 M199 배지에 재현탁합니다. 및 2 ng/ml 인슐린 성장 인자, 인간 피브로넥틴으로 코팅된 24-웰 플레이트에서 7일 동안 배양하였다. EPC 세포는 아세틸-저밀도 지단백질 및 렉틴의 흡수와 EPC 마커의 발현에 의해 확인됩니다. 7일 후에 세포를 수확하고 고정하고 크리스탈 바이올렛 시약으로 염색합니다. 콜로니 밀도는 이미징 측정 소프트웨어를 사용하여 100배 배율로 올림푸스 현미경으로 정량화됩니다.

EPC의 생존 가능성(확산)

250,000개의 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 시딩하고 세포에 200 μl의 배양 배지를 첨가하고 37℃에서 배양한다. 매체 변경은 3일 후에 수행됩니다. 7일째에 플레이트를 100 μl의 신선한 배지 및 추가 50 μl의 2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2 Hydrogen-Tetrazolium-5-Carboxanilide 시약과 함께 다시 배양합니다. , 그리고 4시간 동안 37°C에서 어두운 곳에서 추가로 배양했습니다. 인큐베이션 후, 형성된 주황색 복합체는 450nm 기준 필터가 있는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 판독됩니다.