Efecto de las células progenitoras endoteliales de cilostazol y la formación de colaterales en la enfermedad arterial oclusiva periférica (PAOD)

Comparador activo: Cilostazol

Una tableta (100 mg) dos veces al día durante 12 semanas

Droga: Cilostazol

Una tableta (100 mg) dos veces al día durante 12 semanas

Otros nombres:

• Pletaal (nombre de marca)

Comparador de placebos: Placebo ficticio

Una tableta dos veces al día durante 12 semanas

Droga: Placebo ficticio

Una tableta dos veces al día durante 12 semanas

Otros nombres:

• Placebo
• Control

Número de EPC en circulación

Las células mononucleares de sangre periférica (un millón de células en cada una) se suspenden en 100 µl de solución salina tamponada con fosfato y se incuban durante 30 minutos con anticuerpos monoclonales contra el grupo de antígeno de diferenciación conjugado con proteína de clorofila peridinina humana 45, grupo antihumano conjugado con ficoeritrina de Anticuerpo de diferenciación antígeno-34 y anticuerpo anti-receptor de dominio de inserción de quinasa humana (KDR) conjugado con Alexa Flour 647. Las células se lavan y analizan en un citómetro de flujo FACSCalibur con 100.000 eventos en la puerta de linfocitos. EPC, que se definen como negativas para el grupo de antígeno de diferenciación-45 y positivas para el grupo de antígeno de diferenciación-34 y KDR. En función de los recuentos de células mononucleares de sangre periférica, se calcula el número absoluto de EPC/µL circulantes.

Formación de colonias por EPC

Las células mononucleares de sangre periférica se aíslan mediante centrifugación en gradiente de densidad según protocolos estándar. Después de la centrifugación, las células se lavan, se resuspenden en medio M199 suplementado con suero bovino fetal al 20 % (vol/vol), factor de crecimiento endotelial vascular 10 ng/ml, factor de crecimiento de fibroblastos básico 2 ng/ml, factor de crecimiento epidérmico 10 ng/ml y 2 ng/ml de factor de crecimiento de insulina, y se cultivaron en placas de 24 pocillos recubiertas con fibronectina humana durante 7 días. Las células EPC se confirman mediante la captación de lipoproteínas de baja densidad de acetilo y lectina y mediante la expresión de marcadores EPC. Las células se recogen después de 7 días, se fijan y se tiñen con reactivo cristal violeta. Las densidades de las colonias se cuantifican con un microscopio Olympus con un aumento de 100 veces utilizando un software de medición de imágenes.

Viabilidad (proliferación) de EPC

Se siembran 250.000 células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se añaden a las células 200 µl del medio de cultivo y se incuban a 37°C. El cambio de medio se realiza 3 días después. El séptimo día, la placa se vuelve a incubar con 100 μl de medio fresco y 50 μl adicionales de reactivo de 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2 hidrógeno-tetrazolio-5-carboxanilida y luego se incubaron en la oscuridad a 37°C durante 4 h. Después de la incubación, el complejo de color naranja formado se lee a 450 nm utilizando un lector de microplacas con un filtro de referencia de 450 nm.