MiRNA:iden deregulaatioon liittyvien IL-28B:n rs12979860 ja rs4803217 geenipolymorfismien vaikutus HCV:hen liittyvään hepatosellulaariseen karsinoomaan

Johdanto

Hepatosellulaarinen karsinooma (HCC) on kolmanneksi yleisin syöpäkuolemien syy maailmanlaajuisesti. Huolimatta HCC-hoidon parannuksista, HCC-potilaiden ennuste on edelleen huono uusiutumisten suuren ilmaantuvuuden vuoksi. Parempi ymmärrys HCC:n kehityksen patogeneesistä helpottaisi tehokkaampien tulosten kehittämistä HCC:n diagnoosiin ja hoitoon aikaisemmissa vaiheissa.

Tällä hetkellä kasvaimien molekyylimuutoksia tutkitaan genominlaajuisessa mittakaavassa, ja ne kattavat eri ulottuvuuksia, kuten geeniekspression, epigeneettiset muutokset, kromosomipoikkeavuudet ja viime aikoina seuraavan sukupolven sekvensoinnin. Suuri määrä molekyylimarkkereita liittyy HCC:n kehittymiseen. josta voisi olla hyötyä klinikalla; rodullisia eroja on kuitenkin raportoitu, ja niitä on tutkittava perusteellisemmin.

On arvioitu, että 51,5 % HCC-tapauksista voidaan johtua HCV-infektiosta. Niistä on mainittava IL28B-geenin polymorfismit, mm. rs12979860 C/T ja rs4803217. IL-28B-geeni koodaa interferoni-lamda 3:a (IFN-λ3), joka kuuluu tyypin III IFN-perheeseen, mukaan lukien IFN-λ1, IFN-λ2 ja IFN-λ3. IFN-λ vuorovaikutuksessa transmembraanireseptorin kanssa indusoi voimakkaita antiviraalisia vasteita JAK-STAT- ja MAPK-reittien aktivoitumisen välittämänä. IL-28B-polymorfismit liittyvät tulehdusprosessin tehokkuuteen HCV-infektion aikana ja mekanismeihin, joita HCV ottaa käyttöön paetakseen synnynnäisen ja adaptiivisen immuniteetin avulla. Mielenkiintoista on, että koska tyypin III IFN:n on havaittu estävän sekä HBV:n että HCV:n replikaatiota kokeellisissa malleissa, viime vuosien aikana useissa tutkimuksissa on arvioitu IL-28B-polymorfismien sekä HCC:n ja maksakirroosin (LC) kehittymisriskin välistä yhteyttä. eri populaatioissa; tulokset ovat kuitenkin epäjohdonmukaisia ​​ja epäselviä. Näistä syistä on välttämätöntä ymmärtää syvästi IL28B:n polymorfismien vaikutus HCC:n esiintymiseen.

Mielenkiintoista on, että jotkut polymorfismit, jotka sijaitsevat IL28B:n 3'-kääntämättömällä alueella (UTR), esim. rs 4803217, näyttävät häiritsevän miRNA:n sitoutumista, joka on tähän mennessä tunnustettu tärkeiksi transkription jälkeisiksi säätelijöiksi.

miRNA:t ovat itse asiassa pieniä, häiritseviä, ei-koodaavia RNA:ita, jotka ovat pituudeltaan 21-30 nukleotidia, jotka voivat edistää yli 200 mRNA:n modulaatiota ja jotka liittyvät laajalti ihmisen syöpiin. Viime vuosina miRNA:sta on tullut kasvava merkitys mahdollisina biomarkkereina useille sairauksille, mukaan lukien syöpä.

Erityisesti solunulkoisten miRNA:iden löytäminen, jotka ovat stabiileja verenkierrossa, ajaa monia tutkijoita arvioimaansa tavoitteenaan tunnistaa uusia hyödyllisiä ja vähemmän invasiivisia diagnostisia markkereita myös HCC:lle.

Tavoitteet

Yleisenä tavoitteena on tutkia miRNA:iden säätelyn purkamiseen liittyvien IL-28B rs12979860- ja rs4803217-geenipolymorfismien vaikutusta HCV:hen liittyvään hepatosellulaariseen karsinoomaan.

Erityistavoitteet:

1. Määrittää IL 28B -polymorfismin (polymorfismien) yhteys HCC:n riskiin kroonisilla hepatiitti C -potilailla.
2. Seuloa laaja paneeli miRNA:ita paljastamaan säädellyt ne kroonisen hepatiitti C:n etenemisen aikana kohti HCC:tä
3. Tunnistaa yhteys IL 28B -polymorfismien ja tärkeimpien dereguloitujen miRNA:iden välillä HCC:n ennustajamarkkerina kroonisilla hepatiitti C -potilailla

Tutkimuksen lähestymistapa ja metodologia

Potilaat ja menetelmät:

Potilaat:

Tämä tutkimus sisältää 405 tutkittavaa jaettuna kolmeen ryhmään:

Ryhmä 1. Tähän ryhmään kuuluvat potilaat, joilla on krooninen hepatiitti C (nro =135) Ryhmä 2. Tähän ryhmään kuuluvat potilaat, joilla on krooninen hepatiitti C (nro = 135), joilla on kirroosi (F4).

Ryhmä 3. Tähän ryhmään kuuluvat potilaat, joilla on HCV:hen liittyvä HCC (nro. =135) Tämän vahvistaa kuvantamisen (tietokonetomografia (CT) ja ultraääni) havaitsema fokaalinen leesio ja kohonnut seerumin AFP.

• Otoskoon laskennan perusta on seuraava:

• Alfafetoproteiini: 41-60 %, sp 80-94 %
• HCC:n esiintyvyys HCV-tartunnan saaneista potilaista: 5-10 %
• Laskelma perustuu alfafetoproteiinin spesifisyyteen keskimäärin 87 %

Tarvitaan yhteensä 405 tapausta, keskimäärin 135 tapausta/ryhmä, luotettavuuden 90 ja virhemarginaalin 5 % perusteella, HCC:n esiintyvyys HCV-tartunnan saaneilla potilailla 7 %.

Menetelmät:

1. Seerumin α-fetoproteiinitasot testattiin rutiininomaisesti kaikilta potilailta, joilla oli dekompensoitunut kirroosi. AFP-tasot olivat yleensä kohonneita tapauksissa, jotka osoittautuivat HCC:ksi, mutta tasot vaihtelivat välillä 15-650 ng/ml. HCC-diagnoosi vahvistettiin 4-vaiheisella monidetektoritietokonetomografialla (CT) tai dynaamisella kontrastitehosteella magneettikuvauksella (MRI).
2. HCV RNA:n kvantifiointi. Plasma otetaan ja HCV-RNA määritetään plasman RT-PCR:llä käyttämällä Cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV -testiä (Roche Diagnostics, Branchburg, (NJ).

3. IL28B-polymorfismi:

   SNP rs12979860 ja 4803217 määritetään kokoverestä alleelisella erottelulla käyttämällä erityisiä koettimia reaaliaikaisella PCR:llä.

4. miRNA:n kvantifiointi

   RNA:t uutetaan seerumista käyttämällä miRNeasy Mini Kitiä (Quiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

   RNA:n puhtaus arvioidaan RNA-pitoisuuden perusteella ja kvantifioidaan NanoDrop ND-1000:lla (Nanodrop, Yhdysvallat).

   cDNA saadaan miScript II Reverse Transcription Kits (Quiagen) avulla. Esivahvistus suoritetaan käyttämällä miScript PreAMP PCR Kits (Quiagen) Reaaliaikainen PCRarray tehdään käyttämällä miScript miRNA PCR Arrays, SYBR Green PCR Master Mix (Quiagen) kanssa.

5. Tilastollinen analyysi:

Tilastolliset analyysit tehdään SPSS Statistics -ohjelmistolla. P-arvoja 0,05 pidettiin merkittävinä.

IL28B SNP:iden vertailut tehdään kerrostelemalla potilaat rs12979860CC- ja rs12979860CT/TT-genotyyppien ja 4803217-analyysin mukaan miRNA PCR Array tehdään erityisellä Quiagenin toimittamalla data-analyysiohjelmistolla.