Virkning av IL-28B rs12979860 og rs4803217 genpolymorfismer assosiert med miRNA-deregulering på HCV-relatert hepatocellulært karsinom

Introduksjon

Hepatocellulært karsinom (HCC) er den tredje ledende årsaken til kreftdødsfall på verdensbasis. Til tross for forbedringer i HCC-terapi, er prognosen for HCC-pasienter fortsatt dårlig på grunn av høy forekomst av tilbakefall. En forbedret forståelse av patogenesen av HCC-utvikling vil lette utviklingen av mer effektive resultater for diagnostisering og behandling av HCC på tidligere stadier.

For tiden blir molekylære endringer i svulster gransket i en genom-omfattende skala, og dekker forskjellige dimensjoner, for eksempel genuttrykk, epigenetiske endringer, kromosomavvik, og mer nylig, neste generasjons sekvensering. Et stort antall molekylære markører er assosiert med utviklingen av HCC. som kan være nyttig i klinikken; Det er imidlertid rapportert om raseforskjeller, og disse må undersøkes mer grundig.

Det er anslått at 51,5 % av HCC-tilfellene kan tilskrives HCV-infeksjon. Blant dem må vi nevne polymorfismene til IL28B-genet, f.eks. rs12979860 C/T og rs4803217. IL-28B-genet koder for interferon-lamda 3 (IFN-λ3), som tilhører type III IFN-familien inkludert IFN-λ1, IFN-λ2 og IFN-λ3. IFN-λ som interagerer med en transmembranreseptor induserer potente antivirale responser mediert av aktiveringen av JAK-STAT- og MAPK-veiene. IL-28B polymorfismer er knyttet til effektiviteten av den inflammatoriske prosessen under HCV-infeksjon og til mekanismene som HCV tar i bruk for å unnslippe ved medfødt og adaptiv immunitet. Interessant, siden type III IFN har blitt funnet å hemme både HBV- og HCV-replikasjon i eksperimentelle modeller, har en rekke studier i løpet av de siste årene vurdert sammenhengen mellom IL-28B polymorfismer og risiko for HCC og levercirrhose (LC) utvikling i forskjellige populasjoner; resultatene er imidlertid inkonsekvente og inkonklusive. Av disse grunner er en dyp forståelse av virkningen av IL28B-polymorfismer i HCC-forekomst obligatorisk.

Interessant nok, noen polymorfismer lokalisert ved den 3' utranslaterte regionen (UTR) av IL28B, f.eks. rs 4803217, ser ut til å forstyrre bindingen av miRNA, til dags dato anerkjent som viktige post-transkripsjonelle regulatorer.

miRNA er faktisk små, forstyrrende, ikke-kodende RNA som er 21-30 nukleotider lange, som kan fremme moduleringen av mer enn 200 mRNA og er mye assosiert med kreft hos mennesker. I de siste årene har miRNA fått en økende relevans som potensielle biomarkører for flere sykdommer inkludert kreft.

Spesielt oppdagelsen av ekstracellulært miRNA, som er stabilt i sirkulasjon, driver mange forskere til deres evaluering med sikte på å identifisere nye nyttige og mindre invasive diagnostiske markører også for HCC.

Mål

Det overordnede målet er å undersøke effekten av IL-28B rs12979860 og rs4803217 genpolymorfismer assosiert med miRNAs deregulering på HCV-relatert hepatocellulært karsinom

Spesifikke mål:

1. For å bestemme assosiasjonen mellom IL 28B-polymorfi(er) med risikoen for HCC hos kroniske hepatitt C-pasienter.
2. Å screene et bredt panel av miRNA-er for å avdekke de deregulerte under kronisk hepatitt C-progresjon mot HCC
3. For å identifisere en assosiasjon mellom IL 28B polymorfi(er) og de viktigste deregulerte miRNAene som prediktormarkør for HCC hos kroniske hepatitt C-pasienter

Forskningstilnærming og metodikk

Pasienter og metoder:

Pasienter:

Denne studien vil inkludere 405 emner delt inn i 3 grupper:

Gruppe 1. Denne gruppen vil inkludere pasienter med kronisk hepatitt C (nr. =135) Gruppe2. Denne gruppen vil inkludere pasienter med kronisk hepatitt C (nr. =135) med cirrhose (F4).

Gruppe 3. Denne gruppen vil inkludere pasienter med HCV-relatert HCC (nr. =135) Dette bekreftes ved tilstedeværelse av fokal lesjon detektert ved bildebehandling (computertomografi (CT) og ultralyd), og forhøyet serum-AFP.

• Grunnlaget for beregningen av prøvestørrelsen er følgende:

• Alpha Feto Protein: ses 41-60%, sp 80-94%
• Prevalens av HCC blant HCV-infiserte pasienter: 5-10 %
• Beregningen er basert på spesifisiteten til alfa-feto-proteinet på gjennomsnittlig 87 %

Totalt 405 tilfeller med gjennomsnittlig 135 tilfeller/gruppe er nødvendig, basert på konfidens 90 og feilmargin 5 %, prevalens av HCC blant HCV-infiserte pasienter 7 %

Metoder:

1. Serum α-fetoproteinnivåer ble rutinemessig testet hos alle pasienter med dekompensert cirrhose. AFP-nivåer var generelt forhøyet i tilfeller som ble påvist å være HCC, men nivåene varierte fra 15 til 650 ng/ml. Diagnosen HCC ble bekreftet av en 4-fase multidetektor computertomografi (CT) skanning eller dynamisk kontrastforsterket magnetisk resonansavbildning (MRI).
2. HCV RNA kvantifisering. Plasma vil bli oppnådd og HCV RNA bestemt ved RT-PCR av plasma ved bruk av Cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test (Roche Diagnostics, Branchburg, (NJ).

3. IL28B polymorfisme:

   SNP rs12979860 og 4803217 vil bli bestemt i fullblod ved allelisk diskriminering ved bruk av spesifikke prober ved sanntids PCR.

4. miRNA kvantifisering

   RNA vil bli ekstrahert fra serum ved hjelp av miRNeasy Mini Kit (Quiagen) i henhold til produsentens instruksjoner.

   RNA-renheten vil bli vurdert av RNA-konsentrasjonen og kvantifisert ved NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, USA).

   cDNA vil bli oppnådd ved hjelp av miScript II Reverse Transkripsjonssett (Quiagen) En forhåndsforsterkning vil bli utført ved bruk av miScript PreAMP PCR-sett (Quiagen) Real Time PCRarray vil bli utført ved bruk av miScript miRNA PCR-arrayer, med SYBR Green PCR Master Mix (Quiagen).

5. Statistisk analyse:

Statistiske analyser vil bli utført ved bruk av SPSS Statistics programvare. P-verdier, 0,05 ble ansett som signifikante.

IL28B SNP-sammenligninger vil bli gjort ved å stratifisere pasienter i henhold til rs12979860CC og rs12979860CT/TT genotyper og 4803217 Analyse miRNA PCR Array vil bli utført av spesifikk dataanalyseprogramvare spesifikt levert av Quiagen.