Impacto de los polimorfismos genéticos rs12979860 y rs4803217 de IL-28B asociados con la desregulación de miARN en el carcinoma hepatocelular relacionado con el VHC

Introducción

El carcinoma hepatocelular (HCC) es la tercera causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo. A pesar de las mejoras en el tratamiento del CHC, el pronóstico de los pacientes con CHC sigue siendo malo debido a la alta incidencia de recurrencia. Una mejor comprensión de la patogénesis del desarrollo de CHC facilitaría el desarrollo de resultados más efectivos para el diagnóstico y tratamiento de CHC en etapas más tempranas.

Actualmente, las alteraciones moleculares en los tumores se están examinando a escala de todo el genoma, cubriendo diferentes dimensiones, como la expresión génica, los cambios epigenéticos, las aberraciones cromosómicas y, más recientemente, la secuenciación de próxima generación. Un gran número de marcadores moleculares están asociados con el desarrollo de CHC. que podría ser útil en la clínica; sin embargo, se han informado diferencias raciales y es necesario examinarlas más a fondo.

Se estima que el 51,5% de los casos de CHC se pueden atribuir a la infección por el VHC. Entre ellos, tenemos que mencionar los polimorfismos del gen IL28B, p. rs12979860 C/T y rs4803217. El gen IL-28B codifica el interferón-lamda 3 (IFN-λ3), que pertenece a la familia de IFN de tipo III, que incluye IFN-λ1, IFN-λ2 e IFN-λ3. La interacción de IFN-λ con un receptor transmembrana induce potentes respuestas antivirales mediadas por la activación de las vías JAK-STAT y MAPK. Los polimorfismos de IL-28B están relacionados con la eficiencia del proceso inflamatorio durante la infección por VHC y con los mecanismos que adopta el VHC para escapar por la inmunidad innata y adaptativa. Curiosamente, dado que se ha descubierto que el IFN tipo III inhibe la replicación tanto del VHB como del VHC en modelos experimentales, durante los últimos años, varios estudios han evaluado la asociación entre los polimorfismos de IL-28B y el riesgo de desarrollo de CHC y cirrosis hepática (LC). en diferentes poblaciones; sin embargo, los resultados son inconsistentes y no concluyentes. Por estas razones, es obligatoria una comprensión profunda del impacto de los polimorfismos de IL28B en la aparición de CHC.

Curiosamente, algunos polimorfismos ubicados en la región no traducida (UTR) 3' de IL28B, p. rs 4803217, parecen interferir con la unión de miRNA, reconocidos hasta la fecha como importantes reguladores postranscripcionales.

Los miARN, de hecho, son ARN pequeños, de interferencia y no codificantes que tienen una longitud de 21 a 30 nucleótidos, que pueden promover la modulación de más de 200 ARNm y están ampliamente asociados con los cánceres humanos. En los últimos años, los miARN adquirieron una creciente relevancia como biomarcadores potenciales para varias enfermedades, incluido el cáncer.

En particular, el descubrimiento de miARN extracelulares, que son estables en la circulación, impulsa a muchos investigadores a evaluarlos con el fin de identificar nuevos marcadores de diagnóstico útiles y menos invasivos también para el CHC.

Objetivos

El objetivo general es investigar el impacto de los polimorfismos de los genes IL-28B rs12979860 y rs4803217 asociados con la desregulación de los miARN en el carcinoma hepatocelular relacionado con el VHC.

Objetivos específicos:

1. Determinar la asociación de los polimorfismos IL 28B con el riesgo de CHC en pacientes con hepatitis C crónica.
2. Examinar un amplio panel de miARN para descubrir los desregulados durante la progresión de la hepatitis C crónica hacia el CHC
3. Identificar una asociación entre los polimorfismos IL 28B y los principales miARN desregulados como marcador predictivo de CHC en pacientes con hepatitis C crónica

Enfoque y Metodología de la Investigación

Pacientes y métodos:

Pacientes:

Este estudio incluirá 405 Sujetos divididos en 3 grupos:

Grupo 1. En este grupo se incluirán pacientes con hepatitis C crónica (n° =135) Grupo2. En este grupo se incluirán pacientes con hepatitis C crónica (n° =135) con cirrosis (F4).

Grupo3. Este grupo incluirá pacientes con CHC relacionado con el VHC (no. =135) Esto se confirma por la presencia de lesión focal detectada por Imagen (tomografía computarizada (TC) y ultrasonido) y AFP sérica elevada.

• La base para el cálculo del tamaño de la muestra es la siguiente:

• Proteína Alfa Feto: ses 41-60%, sp 80-94%
• Prevalencia de CHC entre pacientes infectados por VHC: 5-10%
• El cálculo se basa en la especificidad de la proteína alfa feto en un promedio del 87 %

Se requiere un total de 405 casos con un promedio de 135 casos/grupo, basado en confianza 90 y margen de error 5 %, prevalencia de HCC entre pacientes infectados con VHC 7 %

Métodos:

1. Los niveles séricos de fetoproteína α se analizaron de forma rutinaria en todos los pacientes con cirrosis descompensada. Los niveles de AFP generalmente estaban elevados en los casos que se demostró que eran HCC, sin embargo, los niveles oscilaron entre 15 y 650 ng/ml. El diagnóstico de CHC se confirmó mediante una tomografía computarizada (TC) multidetector de 4 fases o una resonancia magnética nuclear (RMN) mejorada con contraste dinámico.
2. Cuantificación del ARN del VHC. Se obtendrá plasma y se determinará el ARN del VHC mediante RT-PCR de plasma utilizando la prueba Cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV (Roche Diagnostics, Branchburg, (NJ).

3. Polimorfismo IL28B:

   Los SNP rs12979860 y 4803217 se determinarán en sangre total mediante discriminación alélica utilizando sondas específicas mediante PCR en tiempo real.

4. cuantificación de miARN

   Los ARN se extraerán del suero utilizando miRNeasy Mini Kit (Quiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

   La pureza del ARN será evaluada por la concentración de ARN y cuantificada por NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, Estados Unidos).

   El cDNA se obtendrá con los kits de transcripción inversa miScript II (Quiagen) Se realizará una preamplificación con los kits miScript PreAMP PCR (Quiagen) Se realizará una PCRarray en tiempo real con miScript miRNA PCR Arrays, con SYBR Green PCR Master Mix (Quiagen).

5. Análisis estadístico:

Los análisis estadísticos se realizarán utilizando el software SPSS Statistics. Los valores de p, 0,05 se consideraron significativos.

Las comparaciones de SNP de IL28B se realizarán estratificando a los pacientes según los genotipos rs12979860CC y rs12979860CT/TT y el análisis 4803217 miRNA PCR Array se realizará mediante un software de análisis de datos específico suministrado específicamente por Quiagen.