Wpływ polimorfizmów genów IL-28B rs12979860 i rs4803217 związanych z deregulacją miRNA na raka wątrobowokomórkowego związanego z HCV

Wstęp

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka na świecie. Pomimo poprawy w leczeniu HCC, rokowanie dla pacjentów z HCC pozostaje złe ze względu na dużą częstość nawrotów. Lepsze zrozumienie patogenezy rozwoju HCC ułatwiłoby opracowanie skuteczniejszych wyników diagnozowania i leczenia HCC na wcześniejszych etapach.

Obecnie zmiany molekularne w nowotworach są analizowane w skali całego genomu, obejmując różne wymiary, takie jak ekspresja genów, zmiany epigenetyczne, aberracje chromosomalne, a ostatnio sekwencjonowanie nowej generacji. Z rozwojem HCC związana jest duża liczba markerów molekularnych. które mogą być przydatne w klinice; jednak odnotowano różnice rasowe i należy je dokładniej zbadać.

Szacuje się, że 51,5% przypadków HCC można przypisać zakażeniu HCV. Wśród nich wymienić należy polimorfizmy genu IL28B, m.in. rs12979860 C/T i rs4803217. Gen IL-28B koduje interferon-lamda 3 (IFN-λ3), który należy do rodziny IFN typu III obejmującej IFN-λ1, IFN-λ2 i IFN-λ3. Interakcja IFN-λ z receptorem transbłonowym indukuje silne odpowiedzi przeciwwirusowe, w których pośredniczy aktywacja szlaków JAK-STAT i MAPK. Polimorfizmy IL-28B są powiązane z wydajnością procesu zapalnego podczas zakażenia HCV oraz z mechanizmami, które HCV przyjmuje do ucieczki przez odporność wrodzoną i adaptacyjną. Co ciekawe, ponieważ stwierdzono, że IFN typu III hamuje zarówno replikację HBV, jak i HCV w modelach eksperymentalnych, w ciągu ostatnich lat w wielu badaniach oceniano związek między polimorfizmami IL-28B a ryzykiem rozwoju HCC i marskości wątroby (LC) w różnych populacjach; jednak wyniki są niespójne i niejednoznaczne. Z tych powodów dogłębne zrozumienie wpływu polimorfizmów IL28B na występowanie HCC jest obowiązkowe.

Co ciekawe, niektóre polimorfizmy zlokalizowane w nieulegającym translacji regionie 3' (UTR) IL28B, np. rs 4803217, wydają się zakłócać wiązanie miRNA, dotychczas uznawanego za ważne regulatory potranskrypcyjne.

W rzeczywistości miRNA to małe, zakłócające, niekodujące RNA o długości 21-30 nukleotydów, które mogą promować modulację ponad 200 mRNA i są szeroko związane z ludzkimi nowotworami. W ostatnich latach miRNA zyskało coraz większe znaczenie jako potencjalne biomarkery kilku chorób, w tym raka.

W szczególności odkrycie pozakomórkowych miRNA, które są stabilne w krążeniu, napędza wielu badaczy do ich oceny mającej na celu identyfikację nowych użytecznych i mniej inwazyjnych markerów diagnostycznych również dla HCC.

Cele

Ogólnym celem jest zbadanie wpływu polimorfizmów genów IL-28B rs12979860 i rs4803217 związanych z deregulacją miRNA na raka wątrobowokomórkowego związanego z HCV

Konkretne cele:

1. Określenie związku polimorfizmu(ów) IL 28B z ryzykiem HCC u pacjentów z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu C.
2. Przeszukiwanie szerokiego panelu miRNA w celu wykrycia deregulacji podczas progresji przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu C w kierunku HCC
3. Identyfikacja związku między polimorfizmem (polimorfizmami) IL 28B a głównymi rozregulowanymi miRNA jako markerem predykcyjnym HCC u pacjentów z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu C

Podejście badawcze i metodologia

Pacjenci i metody:

Pacjenci:

Badanie to obejmie 405 pacjentów podzielonych na 3 grupy:

Grupa 1. Do tej grupy będą należeć pacjenci z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu C (nr =135) Grupa2. Do tej grupy będą należeć pacjenci z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu C (nr =135) z marskością wątroby (F4).

Grupa3. Do tej grupy będą należeć pacjenci z HCC związanym z HCV (nr. =135) Potwierdza to obecność zmiany ogniskowej wykrytej za pomocą obrazowania (tomografia komputerowa (CT) i ultrasonografia) oraz podwyższony poziom AFP w surowicy.

• Podstawa obliczenia wielkości próby jest następująca:

• Białko Alfa Feto: ses 41-60% , sp 80-94%
• Częstość występowania HCC wśród pacjentów zakażonych HCV: 5-10%
• Obliczenia opierają się na specyficzności białka alfa feto na poziomie średnio 87%

Wymaganych jest ogółem 405 przypadków, przy średniej 135 przypadków na grupę, w oparciu o pewność 90 i margines błędu 5%, rozpowszechnienie HCC wśród pacjentów zakażonych HCV 7%

Metody:

1. U wszystkich pacjentów ze zdekompensowaną marskością wątroby rutynowo badano poziomy fetoproteiny w surowicy. Poziomy AFP były na ogół podwyższone w przypadkach, które okazały się HCC, jednak poziomy wahały się od 15 do 650 ng/ml. Rozpoznanie HCC potwierdzono za pomocą 4-fazowej wielorzędowej tomografii komputerowej (CT) lub rezonansu magnetycznego (MRI) ze wzmocnionym kontrastem dynamicznym.
2. Oznaczanie ilościowe RNA HCV. Osocze zostanie uzyskane, a RNA HCV zostanie określone przez RT-PCR osocza przy użyciu testu Cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV (Roche Diagnostics, Branchburg, (NJ).

3. Polimorfizm IL28B:

   SNP rs12979860 i 4803217 zostaną określone w krwi pełnej przez dyskryminację alleli przy użyciu specyficznych sond metodą PCR w czasie rzeczywistym.

4. oznaczanie ilościowe miRNA

   RNA zostanie wyekstrahowane z surowicy za pomocą miRNeasy Mini Kit (Quiagen) zgodnie z instrukcją producenta.

   Czystość RNA zostanie oceniona na podstawie stężenia RNA i określona ilościowo za pomocą NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, Stany Zjednoczone).

   cDNA zostanie uzyskane przy użyciu zestawów do odwrotnej transkrypcji miScript II (Quiagen). A Preamplifikacja zostanie przeprowadzona przy użyciu zestawów miScript PreAMP PCR Kit (Quiagen). Real Time PCRarray zostanie wykonany przy użyciu miScript miRNA PCR Arrays, z SYBR Green PCR Master Mix (Quiagen).

5. Analiza statystyczna:

Analizy statystyczne zostaną przeprowadzone przy użyciu oprogramowania SPSS Statistics. Wartości P 0,05 uznano za istotne.

Porównania SNP IL28B zostaną przeprowadzone przez stratyfikację pacjentów zgodnie z genotypami rs12979860CC i rs12979860CT/TT, a 4803217 Analiza miRNA PCR Array zostanie przeprowadzona za pomocą specjalnego oprogramowania do analizy danych, specjalnie dostarczonego przez firmę Quiagen.