Dopad genových polymorfismů IL-28B rs12979860 a rs4803217 spojených s deregulací miRNA na hepatocelulární karcinom související s HCV

Úvod

Hepatocelulární karcinom (HCC) je celosvětově třetí nejčastější příčinou úmrtí na rakovinu. Navzdory zlepšení léčby HCC zůstává prognóza pacientů s HCC špatná kvůli vysokému výskytu recidivy. Lepší pochopení patogeneze vývoje HCC by usnadnilo vývoj efektivnějších výsledků pro diagnostiku a léčbu HCC v časnějších stádiích.

V současné době se molekulární změny v nádorech zkoumají v celém genomovém měřítku, které pokrývají různé dimenze, jako je genová exprese, epigenetické změny, chromozomální aberace a v poslední době sekvenování nové generace. S rozvojem HCC je spojeno velké množství molekulárních markerů. které by mohly být užitečné na klinice; byly však hlášeny rasové rozdíly, které je třeba důkladněji prozkoumat.

Odhaduje se, že 51,5 % případů HCC lze připsat infekci HCV. Mezi nimi musíme zmínit polymorfismy genu IL28B, např. rs12979860 C/T a rs4803217. Gen IL-28B kóduje interferon-lamda 3 (IFN-λ3), který patří do rodiny IFN typu III zahrnující IFN-λ1, IFN-λ2 a IFN-λ3. IFN-λ interagující s transmembránovým receptorem indukuje silné antivirové reakce zprostředkované aktivací drah JAK-STAT a MAPK. Polymorfismy IL-28B jsou spojeny s účinností zánětlivého procesu během infekce HCV a s mechanismy, které HCV využívá k úniku prostřednictvím vrozené a adaptivní imunity. Je zajímavé, že vzhledem k tomu, že bylo zjištěno, že IFN typu III inhibuje replikaci HBV i HCV v experimentálních modelech, v posledních letech řada studií hodnotila souvislost mezi polymorfismy IL-28B a rizikem rozvoje HCC a jaterní cirhózy (LC). v různých populacích; výsledky jsou však nekonzistentní a neprůkazné. Z těchto důvodů je nutné hluboké pochopení vlivu polymorfismů IL28B na výskyt HCC.

Je zajímavé, že některé polymorfismy lokalizované v 3' nepřekládané oblasti (UTR) IL28B, např. rs 4803217, zdá se, že interferuje s vazbou miRNA, dosud uznávané jako důležité post-transkripční regulátory.

miRNA jsou ve skutečnosti malé, interferující, nekódující RNA, které jsou dlouhé 21-30 nukleotidů, které mohou podporovat modulaci více než 200 mRNA a jsou široce spojovány s lidskými rakovinami. V posledních letech získala miRNA rostoucí význam jako potenciální biomarkery pro několik onemocnění včetně rakoviny.

Zejména objev extracelulárních miRNA, které jsou v oběhu stabilní, žene mnoho výzkumníků k jejich hodnocení s cílem identifikovat nové užitečné a méně invazivní diagnostické markery také pro HCC.

Cíle

Celkovým cílem je prozkoumat dopad polymorfismů genů IL-28B rs12979860 a rs4803217 spojených s deregulací miRNA na hepatocelulární karcinom související s HCV

Specifické cíle:

1. Stanovit asociaci polymorfismu(ů) IL 28B s rizikem HCC u pacientů s chronickou hepatitidou C.
2. Screening širokého panelu miRNA k odhalení těch deregulovaných během progrese chronické hepatitidy C směrem k HCC
3. Identifikovat asociaci mezi polymorfismem(y) IL 28B a hlavními deregulovanými miRNA jako prediktorový marker HCC u pacientů s chronickou hepatitidou C

Výzkumný přístup a metodika

Pacienti a metody:

Pacienti:

Tato studie bude zahrnovat 405 subjektů rozdělených do 3 skupin:

Skupina 1. Tato skupina bude zahrnovat pacienty s chronickou hepatitidou C (č. =135) Skupina2. Tato skupina bude zahrnovat pacienty s chronickou hepatitidou C (č. =135) s cirhózou (F4).

Skupina3. Tato skupina bude zahrnovat pacienty s HCC související s HCV (č. =135) To je potvrzeno přítomností fokální léze detekované zobrazením (počítačová tomografie (CT) a ultrazvuk) a zvýšeným sérovým AFP.

• Základem výpočtu velikosti vzorku je následující:

• Alfa Feto Protein: 41-60%, sp 80-94%
• Prevalence HCC u pacientů infikovaných HCV: 5–10 %
• Výpočet je založen na specificitě alfa feto proteinu v průměru 87 %

Je požadováno celkem 405 případů s průměrem 135 případů/skupina, na základě spolehlivosti 90 a meze chyby 5 %, prevalence HCC mezi pacienty infikovanými HCV 7 %

Metody:

1. Hladiny α fetoproteinu v séru byly rutinně testovány u všech pacientů s dekompenzovanou cirhózou. Hladiny AFP byly obecně zvýšené v případech, u kterých bylo prokázáno, že jde o HCC, nicméně hladiny se pohybovaly od 15 do 650 ng/ml. Diagnóza HCC byla potvrzena 4fázovým multidetektorovým počítačovým tomografem (CT) nebo zobrazením pomocí dynamického kontrastu magnetickou rezonancí (MRI).
2. Kvantifikace HCV RNA. Plazma bude získána a HCV RNA stanovena pomocí RT-PCR plazmy za použití Cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV testu (Roche Diagnostics, Branchburg, (NJ).

3. Polymorfismus IL28B:

   SNP rs12979860 a 4803217 budou stanoveny v plné krvi pomocí alelické diskriminace pomocí specifických sond pomocí PCR v reálném čase.

4. kvantifikace miRNA

   RNA budou extrahovány ze séra pomocí miRNeasy Mini Kit (Quiagen) podle pokynů výrobce.

   Čistota RNA bude hodnocena koncentrací RNA a kvantifikována pomocí NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, Spojené státy americké).

   cDNA bude získána pomocí souprav miScript II pro reverzní transkripci (Quiagen) Předamplifikace bude provedena pomocí souprav miScript PreAMP PCR (Quiagen) Real Time PCRarray bude provedena pomocí miScript miRNA PCR Arrays se SYBR Green PCR Master Mix (Quiagen).

5. Statistická analýza:

Statistické analýzy budou provedeny pomocí softwaru SPSS Statistics. P-hodnoty 0,05 byly považovány za významné.

Porovnání IL28B SNP bude provedeno stratifikací pacientů podle genotypů rs12979860CC a rs12979860CT/TT a analýza miRNA PCR Array 4803217 bude provedena pomocí specifického softwaru pro analýzu dat, který je specificky dodán společností Quiagen.